豬殃殃抗雙氟磺草胺的生理機制研究

馬鵬生

寧夏大學農學院,寧夏銀川750000

豬殃殃抗雙氟磺草胺的生理機制研究

馬鵬生

寧夏大學農學院,寧夏銀川750000

本文通過田間試驗和室內分析測定，對敏感性豬殃殃（S生物型）和抗性豬殃殃（R生物型）生理指標變化進行了初步研究。試驗結果表明：在田間推薦用量上限4.5 g a.i·hm-2雙氟磺草胺處理后，R生物型體內的ALS活力表現為先降低后增高趨勢，第7 d時達到峰值，是對照的1.4倍。而S生物型體內ALS活力隨著處理時間延長也逐漸降低。通過對保護性酶POD、SOD研究結果表明，R生物型噴藥后，體內的POD變化呈增高-降低-增高的趨勢，第7 d時達到峰值，比對照高16.5 g-1·FW-1，SOD變化趨勢則表現為先降低后增高。S生物型在處理后第4 d，體內的POD活性顯著下降，7 d時降到最低，而SOD變化則為隨著處理時間延長，SOD活性也逐漸降低。綜合分析表明，R生物型在受到雙氟磺草胺脅迫后，植株能夠進行正常生長，靶標酶ALS仍然保持較高的活性，保護性酶POD、SOD持續(xù)穩(wěn)定是對雙氟磺草胺產生抗性的主要生理機制。

豬殃殃;雙氟磺草胺;ALS活性;保護性酶

豬殃殃（Galium aparine L.）屬茜草科一年生或越年生雜草，攀援或蔓生，是黃河以南各省冬小麥、冬油菜田中最重要的惡性雜草之一。雙氟磺草胺是美國陶氏益農公司在20世紀90年代中期開發(fā)的三唑嘧啶磺酰胺類除草劑，主要用來防治麥田豬殃殃、野油菜、繁縷、播娘蒿、薺菜等闊葉雜草。其作用機理是通過抑制植物中特有的乙酰乳酸合成酶(ALS)從而阻礙植物細胞的分裂與伸長，抑制支鏈氨基酸的生物合成途徑，阻斷細胞分裂過程中從G2到M階段，以及GI到S過渡，達到殺死雜草的目的[1]。近年來根據調查發(fā)現，麥田豬殃殃已經對抑制ALS位點的除草劑產生一定的抗藥性[2]。彭學崗等[3]在研究豬殃殃抗性過程中發(fā)現，北方不同省份豬殃殃對苯磺隆的抗藥性有很大的差異。其中抗性程度最高為河南省，抗性倍數達到4.3倍。毛海燕等[4]在生產實踐過程中也發(fā)現苯磺隆對豬殃殃的防效明顯下降的現象，但這些研究都僅僅局限于對磺酰脲類除草劑的抗性上面。有關豬殃殃對磺酰胺類除草劑的抗性問題至今國內還未見報道。因此，本試驗通過測定雙氟磺草胺處理后的R生物型和S生物型體內靶標酶ALS、主要保護性酶SOD、POD的變化情況，明確其對雙氟磺草胺的抗性程度及抗性產生的生理機制，以其為今后如何治理抗性豬殃殃奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1 供試試劑試驗除草劑為5%雙氟磺草胺懸浮劑，由美國陶氏益農（中國）有限公司生產。本試驗所用的化學及生化試劑見（下表1）。

表1 化學及生化試劑Table1 Chemicals and Biochemicals

1.1.2 供試儀器本試驗使用的儀器有恒溫水浴振蕩器，由金壇市金南儀器制造有限公司生產；高速冷凍離心機(2～16 p)，由德國Sigma公司生產；UV-2201型紫外分光光度計，由上海譜元儀器有限公司生產。

1.1.3 供試材料本試驗的豬殃殃均采自于河南省駐馬店市麥田。

1.2測定項目與方法

1.2.1 ALS活性測定

1.2.1.1 溶液配制方法

磷酸緩沖液：配制50 mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4PH=7.0的緩沖溶液；酶提取液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1TPP，1 mmol·L-1丙酮酸鈉PH7.0的磷酸緩沖液；酶溶解液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2的0.1 mol·L-1，20 mmol·L-1丙酮酸鈉pH 7.0的磷酸緩沖液。

1.2.1.2 ALS提取方法

參照Fan等[5]方法并稍作改動。準確稱量0.5 g的豬殃殃葉片剪碎后立即放入預冷的研缽中，加入少許液氮，5 mL酶液及石英砂，在冰浴上進行持續(xù)研磨，當葉片成于勻漿時，倒入事先準備好的離心管中，定容至8 mL，于25000 g 4℃下離心30 min，用移液槍將上清液置于新的試管中，加入(NH4)2SO4晶體，使之飽和度達到50%左右，當溶液沉淀2 h后，于25000 g 4℃下離心20 min，把上清液倒掉，加入8 mL酶溶解液中待測。

1.2.1.3 ALS活性測定方法

首先在10 mL的玻璃試管中加入1 mL酶液，0.1 mL磷酸緩沖液及0.8 mL酶反應液，搖勻后在32℃的恒溫水浴鍋中進行1 h的暗反應，之后加入0.2 mL 3 mol/L H2SO4讓其中止反應，在60℃水浴鍋中脫羧10 min，在加入1 mL 5%甲萘酚和1 mL0.5%肌酸顯色20 min，隨后立即轉入到冰浴中冷卻1 min，在525 nm波長下進行比色。

1.2.2 過氧化物酶POD活性測定

1.2.2.1 酶液配制與提取

參照李合生等[6]方法并稍作改動，酶提取液配制：配置0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚溶液；0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸緩沖液。

酶液的提?。簻蚀_稱取0.5 g材料，剪碎后放入液氮預冷的研缽中，加入3 mL的磷酸緩沖液進行持續(xù)研磨，當狀態(tài)為勻漿時，將其倒入離心管中。放置4℃條件下，提取1 d，然后于25000 g 4℃下離心20 min

取上清夜即為酶提取液。

1.2.2.2 POD酶活性的測定

POD酶活性測定的反應體系包括：1.0 mL 2%H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚溶液；2.9 mL 0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸緩沖液，0.2 mL酶液，反應體系加入上述酶液之后，在水浴35℃保溫3～5 min，在470 nm波長下進行比色，每隔1 min測定1次，記錄吸光度值，酶活性單位(u)以每min內A470變化0.01為一個。

1.2.3 抗氧化酶SOD活性測定

1.2.3.1 酶液提取

參照趙世杰等[7]方法并稍作改動，將待測0.5 g材料切碎之后，放入研缽中，加入1 mL提取液和少許石英砂，在冰浴下快速研磨，當成漿時，倒入離心管中，加入4～5 mL提取液，于15000 g，4℃下進行離心15 min，取上清夜為SOD粗提液。

1.2.3.2 SOD酶活性測定反應體系

表2 SOD酶活性測定的反應體系Table 2 SOD activity assay of reaction system

1.2.3.3 SOD活性的測定和計算

反應的步驟如下，首先將空白試管用黑紙包起來，其他反應的試管放置于日光燈15000 LX下進行反應，反應時間為15 min左右。然后以空白試管作為對照，在波長560 nm下，分別測定其他各管的消光度值，SOD活性單位用抑制NBT光化還原的50%作為一個酶活性單位來表示。

1.3數據統(tǒng)計

用EXCEL 2003和DPS 3.01統(tǒng)計軟件進行方差分析，結果用3次重復的“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1ALS活性分析

由圖1可以看出，在田間推薦劑量上限4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內的ALS活力變化有明顯差異，S生物型經過處理之后ALS活力呈顯著降低趨勢并均低于對照。到第7 d時，比對照降低29 nmol/mg，比R生物型降低45.1 nmol/mg，這表明S生物型體內的ALS酶受到藥劑抑制作用，使合成支鏈氨基酸的能力下降，從而對植株造成毒害作用。而R生物型噴藥后，ALS活力呈先降低后增高趨勢，ALS活力前期受到了短暫的抑制，但抑制作用很快解除，以后一直高于對照。在第7 d時，體內ALS活性達到峰值，是對照的1.4倍(見圖1)。因此，R生物型在處理后體內靶標酶仍然保持較高的活性，是對雙氟磺草胺產生耐性的主要原因之一。

2.2雙氟磺草胺對豬殃殃POD活性的影響

過氧化物酶POD主要的作用是清除植物體內的H2O[8]。在田間推薦上限劑量4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內的POD活性均表現為先增高后降低趨勢（見圖2），并且前3 d都高于對照。第4 d時，R生物型和S生物型POD活性出現兩極分化，R生物型不斷增高，7 d時達到峰值，比對照高16.5 g-1·FW-1。S生物型則不斷降低，7 d時降到最低，比對照低16 g-1·FW-1，比R生物型低32.5 g-1·FW-1。這表明雙氟磺草胺脅迫后，S生物型體內的POD活性逐漸下降，從而降低了清除H2O2的能力，使脂質受到嚴重的損害，吸水性急劇下降導致植物枯死。然而R生物型體內的POD活性增加，及時清除H2O2，使植物健康生長。

圖1 雙氟磺草胺對豬殃殃ALS活力的影響Fig.1 Effect of florasulam on ALS activity of Galium aparine L.

圖2 雙氟磺草胺對豬殃殃POD活性的影響Fig.2 Effect of florasulam on POD activity after spraying Galium aparine L.

2.3雙氟磺草胺對豬殃殃SOD活性的影響

在劑量為4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內的SOD活性差異明顯（見圖3）。S生物型在噴藥后，隨著處理時間延長，SOD活性也逐漸降低，到第7 d時達到最低，比R生物型低290.7 U·g-1·FW-1，比CK低309.5 U·g-1·FW-1。而R生物型SOD活性在噴施雙氟磺草胺后，前3 d表現為降低趨勢，從第4 d開始增高，到6 d時基本恢復到同期對照水平。這表明R生物型在脅迫后，體內的SOD活性逐漸增加，解除了超氧自由基的毒害作用，這可能是對雙氟磺草胺產生抗性的另一個原因。

圖3 雙氟磺草胺對豬殃殃SOD活性的影響Fig.3 Effect of florasulam on SOD activity of Galium aparine L.

3 討論

通過上述研究表明，河南駐馬店地區(qū)麥田豬殃殃已經對雙氟磺草胺產生了一定的抗性，即使田間推薦上限用量也不能達到很好的防效，而有調查研究發(fā)現，雙氟磺草胺已經在該地區(qū)連續(xù)單一用藥10余年之久，長期單一用藥增加了對豬殃殃的選擇壓力，從而產生抗性單體，并逐漸形成抗性種群[9,10]。

通過對性豬殃殃生理指標研究中發(fā)現，在雙氟磺草胺脅迫下，R生物型和S生物型體內的ALS活力變化明顯，S生物型ALS活力隨著時間延長呈顯著性降低趨勢，這表明ALS活力酶受到抑制，使之合成支鏈氨基酸的能力降低，造成蛋白質合成紊亂而死亡[11]，這與隋標峰等[12]研究麥田抗性雜草在苯磺隆處理后，乙酰乳酸合成酶的活性一直增加的結果是一致的。另外，有文獻報道ALS基因突變或過量表達是雜草對除草劑敏感性降低的主要分子機制[13]。關于本文所研究的R型豬殃殃抗性分子機制需要在今后通過分子檢測手段來確定。

從生理指標POD、SOD酶的活性研究發(fā)現，在雙氟磺草胺脅迫下，S生物型體內的保護酶POD、SOD活性不斷降低，然而R生物型體內的POD活性則高于對照，SOD活性變化與對照基本無差異。這表明POD活性隨著處理時間延長而不斷上升，可能是為了維持自身的代謝，而對雙氟磺草胺產生的一種保護機制[14,15]。另外，本文僅研究了豬殃殃在受到雙氟磺草胺脅迫后，植物體內的靶標酶ALS、超氧化物歧化酶SOD、過氧化清酶POD的變化情況，沒有對解毒代謝酶GSTs、P450的變化進行深入分析，也沒有涉及到豬殃殃對雙氟磺草胺的吸收傳導，需要在未來做更進一步研究。

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Study on the Physiological Mechanism of the Resistance of Galium aparine L.against Florasulam

MA Peng-sheng
School of Agriculture Ningxia University,Yinchuan,750000,China

This paper preliminarily studied the physiological symptom change of sensitiveGalium aparineL.(S biotype)and resistantGalium aparineL.(R biotype)through field test and analysis measure in laboratory.The results showed that:the ALS dynamic performance in R biological increased first then decreased after sulfur difluoride alachlor treatment in the field recommended dosage limit 4.5 g a.i hm-2,and reached a peak at 7 d,which is 1.4 times of references.While in S biological, the ALS dynamic performance gradually reduce with the prolong of processing time.Results through the study on protective enzyme POD and SOD showed that POD changes in R biotype after spraying was increasing,reducing and increasing and reach a peak at 7 d,which is 16.5 g-1·FW-1higher than the reference.SOD changing trend was decreasing first then increasing.S biotype at 4 d after processed.POD activity in the body was significantly decreased after treatment and reached a minimum at 7 d.SOD changes prolonged with the prolonging processing time and SOD activity was also decreased. Comprehensive analysis showed that the plants of R bio-type can normally grow after being stressed by double fluoride sulfur alachlor and neuropathy target esterase ALS remained high activity,the sustained and steady protective enzymes POD, SOD was the main physiological mechanism producing anti-sulfonamide to Florasulam.

Galium aparineL.;Florasulam;ALS activity;protective enzymes

TQ450.1+3

A

1000-2324(2014)05-0778-04

2013-04-20

2013-05-12

馬鵬生(1979-),男,漢族,甘肅省靜寧縣人,講師,研究方向:天然藥物藥理學