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    酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?/h1>
    2014-07-05 16:05:30沈薩薩姜靈陸杰于洪巍
    化工進展 2014年9期
    關(guān)鍵詞:映體乙酰基扁桃

    沈薩薩,姜靈,陸杰,于洪巍

    (1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系,浙江 杭州 310028)

    酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?/p>

    沈薩薩1,姜靈2,陸杰1,于洪巍2

    (1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系,浙江 杭州 310028)

    采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙酰基鄰氯扁桃酸進行不對稱水解,利用突變后的扁桃酸消旋酶(V29I)對拆分后的產(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸進行消旋,消旋后的鄰氯扁桃酸經(jīng)過?;匦卤焕玫剿夥磻?yīng)中,實現(xiàn)了酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?。通過對拆分反應(yīng)、拆分混合物的分離回收以及消旋反應(yīng)的工藝優(yōu)化,最終獲得光學(xué)純度ee>99.9%的R-(-)-乙?;徛缺馓宜幔涫章蔬_80%。本研究建立的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的動態(tài)動力學(xué)拆分工藝,對其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

    酶法動態(tài)動力學(xué)拆分;脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011;扁桃酸消旋酶;乙酰基鄰氯扁桃酸;鄰氯扁桃酸

    鄰氯扁桃酸是一種重要的精細化學(xué)品,在醫(yī)藥化學(xué)品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。其中,R-(-)-鄰氯扁桃酸是合成新型血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要中間體[1-3]。隨著氯吡格雷、鄰氯扁桃酸及其衍生物用途的進一步開發(fā),R-(-)-鄰氯扁桃酸的需求量日益增加,但由于受到傳統(tǒng)工藝的限制,市場需求難以得到滿足。

    目前,R-(-)-鄰氯扁桃酸的制備主要有以下幾種方法。①直接利用不對稱合成或還原的方法制備光學(xué)活性的R-(-)-鄰氯扁桃酸。2009年,Yin等[4]利用金屬釕(Ru)作為催化劑催化不對稱氫化法合成R-(-)-鄰氯扁桃酸甲酯,產(chǎn)物的ee值為92%。但反應(yīng)條件較苛刻,且有毒的重金屬易污染底物。②非對映體鹽結(jié)晶法是目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一種拆分技術(shù)。它是利用手性試劑將外消旋體混合物中的兩個對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體,然后利用其物理性質(zhì)的差異將非對映異構(gòu)體分開,從而得到單一異構(gòu)體。但其面臨的共同問題是拆分劑價格昂貴,且有一定的毒性,因此在一定的程度上造成了資源的浪費和環(huán)境的污染。③酶催化拆分方法是利用具有立體選擇性的酶作為催化劑,在此催化劑的作用下,底物的其中一種異構(gòu)體優(yōu)先反應(yīng),從而達到把兩種對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體,實現(xiàn)拆分的目的。如報道的商品酶CAL-A(Novozym 735)可以水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯,產(chǎn)物ee值高達99%以上[5]。但這種方法的理論收率最多50%,造成了資源的浪費。然而動態(tài)動力學(xué)拆分技術(shù)的出現(xiàn)為解決這個問題提出了新的思路。動態(tài)動力學(xué)拆分在動力學(xué)拆分的基礎(chǔ)上添加了反應(yīng)活性較弱的對映體的原位消旋,拆分過程與反應(yīng)活性較弱的對映體原位消旋相繼或同時進行,即某一對映體不斷轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品,而另一對映體則不斷地消旋化補充原料,最終得到理論產(chǎn)率100%的光學(xué)純化合物[6-11]。

    目前利用動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬难芯可形匆妶蟮?。如圖1所示,本研究采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙?;徛缺馓宜徇M行不對稱水解,獲得未反應(yīng)的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸[12-13]。R-(-)-乙?;徛缺馓宜峤?jīng)過水解就可獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸。同時,利用扁桃酸消旋酶使鄰氯扁桃酸產(chǎn)物消旋化,形成鄰氯扁桃酸消旋體,經(jīng)過乙酰化合成拆分底物乙?;徛缺馓宜幔匦伦鳛樵线M入反應(yīng)體系。因此,通過對乙酰基鄰氯扁桃酸進行動態(tài)動力學(xué)拆分獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸前體物是R-(-)-乙?;徛缺馓宜嶂苽涞囊环N有前景的新工藝。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶、乙?;徛缺馓宜幔兌葹?9.9%)和扁桃酸消旋酶(突變體V29I)由實驗室制備。R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜幔ㄙ|(zhì)量分數(shù)為99%),由上海精純試劑有限公司購得。氯仿,分析純,購自上海精純試劑有限公司。乙酸乙酯,分析純,購自杭州化工有限公司。其他試劑均為分析純。

    圖1 乙?;徛缺馓宜岬膭討B(tài)動力學(xué)拆分

    1.2 實驗方法

    1.2.1 乙酰基鄰氯扁桃酸的拆分反應(yīng)

    配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=6.2),取10mL置于25mL的錐形瓶中,加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸,反應(yīng)體系為密閉體系,將反應(yīng)體系置于45℃,200r/min的恒溫搖床中,反應(yīng)5h,獲得R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬孜锖袜徛缺馓宜岙a(chǎn)物。

    1.2.2S-(-)-鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)

    配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=7.5)和濃度10mmol/L的S-(-)-鄰氯扁桃酸。加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液,封閉反應(yīng)體系,將反應(yīng)體系置于30℃,200r/min的恒溫搖床中,反應(yīng)3.5h,獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。

    1.2.3 拆分反應(yīng)后的混合物分離實驗

    首先,向拆分反應(yīng)液中加入不同體積的氯仿萃取溶劑,將該密閉體系置30℃,200r/min的恒溫搖床中,萃取30min。通過萃取收率的大小來確定萃取劑的使用量。然后,根據(jù)確定的萃取劑的使用量,分別研究了在20℃、30℃、40℃下,10min、20min、30min、40min、50min時的萃取收率,篩選出最佳萃取溫度和時間。在以上優(yōu)化條件下,本實驗還研究了萃取次數(shù)對萃取效果的影響。每個實驗均設(shè)置3個平行樣,取平均值。

    1.2.4 乙酰基鄰氯扁桃酸的DKR反應(yīng)

    配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=6.2),取100mL置于250mL的錐形瓶中,加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸,將反應(yīng)體系置于45℃、200r/min的恒溫搖床中,反應(yīng)5h,獲得R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物和鄰氯扁桃酸產(chǎn)物。拆分反應(yīng)結(jié)束后,將體系中的酶離心去除,調(diào)節(jié)pH值至7.5,加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液,將反應(yīng)體系置于30℃、200r/min的恒溫搖床中,反應(yīng)3.5h,獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。采用溶劑萃取法將未反應(yīng)的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸消旋體分離。將鄰氯扁桃酸的消旋體酰化后得到的乙?;徛缺馓宜嶂匦掠糜诓鸱址磻?yīng)。最終實現(xiàn)動態(tài)動力學(xué)拆分的整個過程。

    1.3 分析方法

    分析方法為液相分析法。液相色譜儀為Agilent 1100 series(美國),AD-H柱(4.6nm×250mm),柱溫保持在25℃,流動相為正己烷和異丙醇,流動相配比為90∶10,流速1mL/min,檢測波長λ=254nm,進樣量保持在20~50μL。在此液相條件下,測得S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸和R-(-)-乙?;徛缺馓宜?、S-(+)-鄰氯扁桃酸和R-(-)-鄰氯扁桃酸的保留時間分別為7.847min、8.450min、13.234min、14.378min。

    底物對映體過量值eeS=(CSR-CSS)/(CSR+CSS)× 100%,產(chǎn)物的對映體過量值eeP=(CPS-CPR)/(CPR+CPS)× 100%,轉(zhuǎn)化率由根據(jù)底物的減少計算而得,式中CSS、CSR、CPR和CPS分別為S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-鄰氯扁桃酸和S-(+)-鄰氯扁桃酸的含量。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 乙?;徛缺馓宜岬牟鸱址磻?yīng)

    徐建和課題組[11-12]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011可以催化乙?;徛缺馓宜岬牟粚ΨQ水解,得到R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物鄰氯扁桃酸。此脂肪酶可以優(yōu)先水解S-(-)-乙?;徛缺馓宜?,并且產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的對映體過量值最高可達99%。此反應(yīng)也可同時得到對映體過量值較高的R-(-)-乙?;徛缺馓宜?。在徐建和課題組研究的基礎(chǔ)上,為了獲得高產(chǎn)率的光學(xué)高純度R-(-)-乙?;徛缺馓宜幔瑢χ久复呋鸱址磻?yīng)的條件進行了進一步的優(yōu)化。

    2.1.1 拆分反應(yīng)的溫度

    為了提高R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率,對拆分反應(yīng)的溫度進行了進一步的優(yōu)化研究。如圖2所示,在相同反應(yīng)時間內(nèi),在40℃和45℃反應(yīng)時R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膃e值較高,消旋效果較好。而反應(yīng)溫度在30℃或55℃時酶活受到溫度的影響,導(dǎo)致R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值明顯偏低。因此進一步對40℃和45℃下的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率進行了分析。發(fā)現(xiàn)由于底物自水解的發(fā)生,R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的延長而降低,而在45℃的反應(yīng)條件下,反應(yīng)3.5h內(nèi)(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的產(chǎn)率已經(jīng)開始降低,此時R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸對映體過量值還沒有達到理想值。而在溫度為40℃時,自水解比較緩慢,當R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的ee>99%時,R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的水解量還很少,見圖3。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和產(chǎn)率的最優(yōu)值,確定了最佳反應(yīng)溫度為40℃。

    圖2 溫度對R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值的影響

    圖3 溫度對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸產(chǎn)率的影響

    表1R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率隨時間的變化

    2.1.2 拆分反應(yīng)時間

    拆分反應(yīng)時間對R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率的影響如表1所示。隨著反應(yīng)時間的增加,(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值也隨之增大,當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率超過50%時,eeS>99%。但是隨著反應(yīng)的繼續(xù)進行,底物轉(zhuǎn)化率繼續(xù)升高的同時還伴隨著R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的量逐漸減少。當反應(yīng)時間少于4.25h時,未反應(yīng)的(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率基本保持最大收率,但是對映體過量值不高。當反應(yīng)時間大于4.25h時,未反應(yīng)的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬氖章书_始下降,但其對映體過量值穩(wěn)定在eeS>99.9%。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和收率的最優(yōu)值,確定最佳反應(yīng)時間為4.25h。

    綜合考慮以上影響拆分效果的因素,從拆分反應(yīng)中R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶τ丑w過量和收率值的角度,確定了拆分反應(yīng)的最佳條件:以20mmol/L乙?;徛缺馓宜嶙鳛椴鸱值孜?,將反應(yīng)體系置于40℃、200r/min的恒溫搖床中,反應(yīng)4.25h。

    2.2 鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)

    消旋酶是一種催化底物產(chǎn)生消旋化的酶,它可以將單一的對映體轉(zhuǎn)化為消旋體。本實驗中鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)就是通過扁桃酸消旋酶催化的。將拆分后產(chǎn)生的鄰氯扁桃酸單一對映體經(jīng)過扁桃酸消旋酶催化產(chǎn)生消旋體鄰氯扁桃酸。得到的消旋體又可經(jīng)過乙?;磻?yīng)轉(zhuǎn)化為拆分底物繼續(xù)進行拆分反應(yīng)。從而在理論上可以使R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬霓D(zhuǎn)化率提高至100%。因此消旋反應(yīng)是動態(tài)動力學(xué)拆分過程中的重要反應(yīng)。為此本實驗對消旋反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化,研究了pH值、溫度和鄰氯扁桃酸濃度對消旋反應(yīng)的影響,確定了消旋反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。

    2.2.1 溫度對消旋反應(yīng)的影響

    推力桿由推力桿頭、柱管、橡膠襯套總成、彈性擋圈組成,其中橡膠襯套總成由橡膠、銷軸構(gòu)成。平衡懸架中的推力桿結(jié)構(gòu)如圖2所示。

    一般情況下,溫度的變化會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致選擇性和反應(yīng)活性發(fā)生變化,因此必須考察反應(yīng)溫度對消旋反應(yīng)的影響。實驗采用相同反應(yīng)體系,分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的搖床內(nèi)反應(yīng)2h。結(jié)果如圖4所示:鄰氯扁桃酸的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而逐漸增加,當溫度在25℃~30℃時,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達到最高,而隨著溫度的進一步升高,酶活隨著溫度的升高而降低,導(dǎo)致消旋效果進降低,使得消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率減少。因此消旋反應(yīng)的最佳溫度范圍為25~30℃。以下實驗溫度均采用30℃。

    圖4 溫度對消旋反應(yīng)的影響

    圖5 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響

    2.2.2 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響

    配制不同濃度的底物S-鄰氯扁桃酸,在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)2h。結(jié)果如圖5所示:隨著底物濃度的增加,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸減少,消旋效果逐漸降低。原因可能是當?shù)孜餄舛冗^高時產(chǎn)生底物抑制效應(yīng),對酶促反應(yīng)的活性產(chǎn)生了消極影響。雖然當?shù)孜餄舛葹?mmol/L時消旋效果最好,可實際得到的產(chǎn)物太少,不利于實驗檢測和回收純化,因此確定10mmol/L為適宜的底物濃度。

    2.2.3 pH值對消旋反應(yīng)的影響

    配制不同pH值(6.0~8.0)的緩沖液,在相同反應(yīng)條件下反應(yīng)2h,結(jié)果如圖6所示:隨著反應(yīng)體系pH值的增大,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加,而當pH=7.5時,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最大,達到39.4%。但隨著pH值的進一步增加,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率反而下降。當繼續(xù)增加消旋反應(yīng)的時間(從2h延長到8h),使反應(yīng)完全進行,結(jié)果顯示:當pH值在6~7范圍或大于7.5時,都有一定的消旋效果。在pH=7.5時,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達50%,底物幾乎完全消旋。因此,消旋反應(yīng)的最佳pH值為7.5。

    圖6 pH值對消旋反應(yīng)的影響

    2.2.4 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

    綜合以上的各項因素,采用優(yōu)化后的條件進行消旋反應(yīng),考察了完全反應(yīng)所需要的時間。結(jié)果如圖7所示:隨著反應(yīng)的進行,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加,當反應(yīng)時間超過3h后,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率接近50%,并且趨于平衡狀態(tài)。因此反應(yīng)3h時,消旋反應(yīng)已經(jīng)進行完全。

    2.3 拆分產(chǎn)物的溶劑萃取分離過程

    圖7 pH值7.5時,轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的變化

    目前對于拆分反應(yīng)后的混合物主要采用柱層析的方法進行分離。但是此方法分離過程繁瑣,分離量較少,經(jīng)濟費用較高,不適合工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)上較常用結(jié)晶和萃取的方法進行分離。從節(jié)約成本和降低耗能的角度,采用溶劑萃取法對乙?;徛缺馓宜岵鸱趾蟮幕旌衔镞M行分離。實驗對萃取劑進行了篩選,然后對R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿┑氖褂昧?、萃取時的溫度和時間、萃取的次數(shù)進行了研究。

    2.3.1 萃取劑的選擇

    本研究從幾種實驗室較常用的有機溶劑中選擇合適的萃取劑,采用乙醚、石油醚、正己烷、氯仿、乙酸乙酯作為萃取劑,分別考察了他們的萃取效果。取相同的酶法制備液,在室溫下,分別加入等體積的上述5種有機溶劑進行1次萃取。萃取結(jié)果見表2。結(jié)果表明:石油醚和正己烷對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸均沒有萃取作用,乙醚和乙酸乙酯對兩種物質(zhì)都有較高的萃取效果,但這兩種有機溶劑無法達到讓兩者分離的效果。只有氯仿能夠有選擇性的萃取R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸,而對鄰氯扁桃酸無萃取效果,因此可以實現(xiàn)前者的有效分離。而乙酸乙酯對兩種物質(zhì)的萃取收率都達到96%以上,因此后續(xù)制備余液中的產(chǎn)物鄰氯扁桃酸可直接用乙酸乙酯萃取回收。為達到兩者的有效分離,首先采用氯仿對酶制備液中的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸進行萃取分離,再對剩余的余液直接用乙酸乙酯進行萃取,分離回收余液中的鄰氯扁桃酸。

    2.3.2 萃取劑用量

    表2 不同有機溶劑對R(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬妮腿⌒Ч?/p>

    工業(yè)中采用有機溶劑進行萃取時,為了減少有機溶劑的用量,減少環(huán)境污染,降低成本,會采用最優(yōu)的萃取劑量進行萃取,以期獲得最大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。因此對萃取劑氯仿在萃取過程中的使用量進行了研究。實驗考察了氯仿/制備液體積比在(1∶4) ~(2∶1)(即氯仿量為2.5~20mL)時對R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿⌒Ч挠绊?,見圖8。結(jié)果表明,當萃取劑氯仿的體積為10~20mL時,對制備液中R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取效果基本保持不變,萃取收率大約在65%。隨著萃取劑體積的增加,萃取收率也不再提高;但萃取劑的體積低于10mL時,由于萃取劑體積比的減小,影響了物質(zhì)在兩相中的分配,導(dǎo)致萃取收率下降。綜合考慮氯仿對R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿』厥招Ч约斑^程中的能耗,宜選用等體積的氯仿(10mL)進行萃取,在此條件下的萃取收率為65%。

    圖8 氯仿用量對R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>

    2.3.3 萃取溫度和時間

    萃取過程中溫度的改變會導(dǎo)致萃取物的擴散速度以及在兩相分配系數(shù)的改變,從而使萃取效果受到較大影響;萃取物在兩相中達到一個分配平衡的狀態(tài)需要一定的時間。因此,萃取時需考慮溫度和時間對萃取效果的影響,期望節(jié)約成本和能耗,并獲得最好的萃取收率。由于萃取的制備液中有Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶的存在,考慮到在萃取過程中水解仍在緩慢進行,為避免R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的進一步損失,實驗應(yīng)避開酶催化反應(yīng)的最佳溫度(50℃),因此選取20~40℃的溫度范圍進行萃取實驗。溫度以及時間對萃取效果的影響結(jié)果見圖9。結(jié)果表明:隨著萃取溫度的升高,萃取收率也在提高,而40℃時的萃取收率明顯高于其他兩個溫度下的萃取收率。同時隨著時間的延長,同溫度下的萃取收率逐漸提高。當萃取時間超過40min時,萃取效果趨于穩(wěn)定。因此在后續(xù)的實驗中選擇的萃取條件為:溫度40℃,時間40min。

    圖9 萃取溫度和時間對R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>

    2.3.4 萃取次數(shù)

    根據(jù)前面確定的萃取條件,氯仿對制備液單次萃取時,R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物的萃取收率僅為75%,為了進一步提高萃取收率,研究考察了萃取次數(shù)對底物萃取效果的影響。在40℃的實驗溫度下,采用等體積的氯仿進行萃取,每次萃取時間均為40min。萃取次數(shù)對萃取效果的影響結(jié)果見圖10。結(jié)果表明:在相同的條件下,對酶制備液萃取不同次數(shù)后,底物R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取收率最高可達到94%。在第2次萃取后,萃取收率明顯升高;而當萃取次數(shù)大于2次時,萃取收率變化不大。因此,在后續(xù)的實驗中確定適宜的萃取次數(shù)為2次。

    綜合考慮以上影響萃取效果的各因素,從節(jié)約成本和降低耗能的角度,確定R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的最優(yōu)萃取條件為:等體積的氯仿進行萃取,萃取溫度為40℃,萃取次數(shù)2次,每次萃取時間均為40min。最終獲得的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿∈章蕿?6%。

    2.4 產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的萃取

    圖10 萃取次數(shù)對R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>

    萃取劑篩選實驗證明乙酸乙酯對鄰氯扁桃酸具有很好的分離效果(室溫萃取收率達到96%以上),因此采用等體積的乙酸乙酯直接對剩余液進行萃取??紤]一次萃取可能無法達到完美的萃取效果,為了進一步提高產(chǎn)物的萃取收率,將萃取次數(shù)提高到2次。最終獲得鄰氯扁桃酸產(chǎn)物的萃取收率為98%。

    對溶劑萃取各條件進行優(yōu)化后,進一步考察了萃取過程對酶反應(yīng)混合物的實際分離效果。采用乙酸乙酯直接萃取酶法制備液得到的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔颷圖11(a)]作為對照,在實驗研究的最優(yōu)萃取條件下,通過氯仿萃取得到高純度的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物[圖11(b)],萃取收率為96%。并通過乙酸乙酯萃取剩余液得到高純度的鄰氯扁桃酸產(chǎn)物[圖11(c)],萃取收率為98%。用液相色譜分別對3種萃取物進行檢測。結(jié)果表明:采用氯仿和乙酸乙酯依次萃取后,可有效地分離R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔?,兩者的純度均達到99.9%。

    圖11 液相色譜檢測結(jié)果

    采用以上實驗獲得的優(yōu)化條件,最終得到R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬氖章蕿?0%,eeS>99.9%。

    3 結(jié) 論

    采用動態(tài)動力學(xué)方法對乙酰基鄰氯扁桃酸消旋體進行拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?。為獲得高產(chǎn)率光學(xué)純的R-(-)-乙?;徛缺馓宜?,實驗對拆分反應(yīng)和消旋反應(yīng)過程分別進行了條件優(yōu)化。在此優(yōu)化條件下,乙?;徛缺馓宜嵯w拆分獲得R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率為47%,對映體過量值ee>99%。將拆分后的混合物通過氯仿和乙酸乙酯進行萃取分離后,將反應(yīng)得到的鄰氯扁桃酸進行消旋化,經(jīng)過3h后就可獲得完全消旋化的鄰氯扁桃酸消旋體。將消旋體鄰氯扁桃酸轉(zhuǎn)化成乙酰基扁桃酸消旋體原料后,繼續(xù)作為原料用于拆分反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)4次,最終得到的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率為80%。此試驗研究打破了傳統(tǒng)動力學(xué)拆分反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率低的局限,實現(xiàn)了高產(chǎn)率光學(xué)純R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的制備分離過程。

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    R-(-)-acetyl-o-mandelic acid preparation via enzymatic dynamic kinetic resolution

    SHEN Sasa1,JIANG Ling2,LU Jie1,YU Hongwei2
    (1School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China;2School of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310028,Zhejiang,China)

    In this study,asymmetric hydrolysis of acetyl chloromandelic acid was catalyzed byPseudomonassp. ECU1011,and theS-(-)-chloromandelic acid in the resolution mixture was then racemerized using the mutated mandelate racemase and fed back into the hydrolysis reaction after acylation,realizing enzymatic dynamic kinetic resolution for preparation ofR-(-)-acetyl chloromandelic acid. Firstly,the conditions for enzymatic resolution,separation of resolution mixture,and enzymatic racemization were optimized. Subsequently,dynamic kinetic resolution of acetyl chloromandelic acid was conducted under the optimal conditions,obtaining optically pureR-(-)-acetyl chloromandelic acid with final yield of 80%. The conditions for enzymatic resolution,chloromandelic acid recycling and racemization were optimized in this study,leading to preliminary establishment of the dynamic kinetic resolution process forR-(-)-acetyl chloromandelic acid preparation,with guiding significance for future industrial applications.

    enzymatic dynamic kinetic resolution;Pseudomonassp. ECU1011 lipase;mandelate racemase;R-(-)-acetyl-o-mandelic acid;chloromandelic acid

    TQ 463;Q 819

    A

    1000-6613(2014)09-2425-07

    10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.032

    2014-01-02;修改稿日期:2014-01-22。

    國家自然科學(xué)基金(21176102、21176215、GZ935)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131100)、江蘇省環(huán)??蒲姓n題基金(2012004)及浙江省自然科學(xué)基金杰出青年基金(21076181)項目。

    沈薩薩(1985—),女,碩士。E-mail sasashen@163.com。聯(lián)系人:陸杰,男,教授,從事結(jié)晶分離和藥物合成等研究。E-mail lujie@jiangnan.edu.cn。

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