牛奶中高分子質(zhì)量蛋白致敏作用的初步研究

侯麗英朱黎娜李 嬋林書祥劉堂喻亨尹 悅李會強△

牛奶中高分子質(zhì)量蛋白致敏作用的初步研究

侯麗英1朱黎娜1李 嬋2林書祥2劉堂喻亨1尹 悅1李會強1△

目的 探討牛奶中高分子質(zhì)量蛋白在牛奶過敏過程中的致敏作用。方法選取牛奶過敏患者血清30例，皮膚點刺試驗陽性，血清特異性IgE（sIgE）檢測結(jié)果均為陽性且≥1+。健康對照血清1例，血清sIgE檢測陰性，無過敏史?？崭共裳?，收集血清于-20℃凍存?zhèn)溆?。利用Sephadex G200凝膠層析獲得牛奶高分子質(zhì)量蛋白，通過蛋白免疫印跡法（Wetern blot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測高分子質(zhì)量蛋白與牛奶過敏患者血清sIgE的結(jié)合活性。結(jié)果SDS-PAGE顯示Sephadex G200凝膠層析純化得到的高分子質(zhì)量蛋白主要包括3條帶，分子質(zhì)量約為67、80和160 ku，推斷其可能是牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白。經(jīng)Western blot分析，3種高分子質(zhì)量蛋白與牛奶過敏患者血清均能反應(yīng)，并且在67 ku附近條帶最明顯。經(jīng)ELISA分析，高分子質(zhì)量蛋白與牛奶過敏患者血清的陽性反應(yīng)率比β-乳球蛋白略高（分別是46.7％、43.3％）。結(jié)論牛奶中高分子質(zhì)量蛋白組分能夠誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，這些組分在牛奶過敏過程中具有重要的致敏作用。

食物過敏；免疫球蛋白E；免疫印跡法；酶聯(lián)免疫吸附測定；牛奶；高分子質(zhì)量蛋白；致敏作用；特異性IgE

食物過敏是一個日益嚴(yán)重的健康問題，在西方國家約6％的兒童對食物過敏[1]。牛奶是最常見的八大食物過敏原之一，也是嬰幼兒飲食最早添加的食物之一[2]。牛奶過敏能夠誘導(dǎo)兒童發(fā)生不良反應(yīng)，可涉及多器官多系統(tǒng)，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，輕重不一，不及時干預(yù)會影響兒童的生長發(fā)育[3]。目前，除了回避過敏原，還沒有合適的治療牛奶過敏的方法[4]。牛奶蛋白組分大約包括25種不同的蛋白質(zhì)[5]，理論上絕大多數(shù)的牛奶蛋白都具有潛在的免疫原性。但是酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是牛奶中主要的過敏原，50％～65％的牛奶過敏患者對其過敏[6]。而目前對高分子質(zhì)量蛋白（60～170 ku）的致敏性研究很少。本課題組的前期研究表明用Sephadex G200分離乳清蛋白時所收集的首個洗脫峰與牛奶過敏患者的陽性血清存在反應(yīng)[7]。因此，本研究應(yīng)用凝膠層析技術(shù)獲得高分子質(zhì)量蛋白組分，再利用蛋白免疫印跡法（Wetern blot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測過敏患兒血清特異性IgE（sIgE）的反應(yīng)性，以評估這些蛋白的致敏活性，為研制高質(zhì)量的牛奶過敏原檢測試劑盒提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 垂直板型電泳儀、半干轉(zhuǎn)印電泳儀和凝膠成像儀均購自美國BIO-RAD公司；蛋白電泳材料十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸、蛋白Marker、堿性磷酸酶（Ap）標(biāo)記的羊抗人-IgE、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鼠抗人-IgE、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、β-乳球蛋白純品等均購自美國Sigma公司；硝酸纖維素膜購自美國PALL公司；凝膠層析填充材料Sephadex G200購自瑞典Pharmacia公司；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板為美國康寧公司產(chǎn)品。

1.2 血清來源 血清標(biāo)本均取自天津市兒童醫(yī)院。陽性血清30例來自牛奶過敏患者，其中男15例，女15例；年齡8個月～5歲，平均4歲±1個月；皮膚點刺試驗陽性，血清sIgE檢測結(jié)果均為陽性且≥1+。陰性血清1例來自健康體檢者，血清sIgE檢測陰性，無過敏史?？崭共裳?，收集血清于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 制備脫脂奶 新鮮牛奶100 mL冷凍離心（4℃）3 000 r/min共15 min，撥開上層脂肪，吸出脫脂乳，雙層紗布過濾后，獲得脫脂奶。

1.3.2 凝膠層析初步分離脫脂奶 取1.3.1中制備的牛奶蛋白粗提液進(jìn)行Sephadex G200凝膠層析，調(diào)整蛋白濃度為5～10 g/L。常規(guī)處理Sephadex G200凝膠并裝柱，平衡緩沖液為0.01 mol/L PBS pH7.4，紫外檢測洗脫液蛋白濃度，凝膠層析收集各蛋白峰，監(jiān)測到4個洗脫峰，第1個峰為高分子質(zhì)量蛋白，其他3個峰為小分子蛋白，分別收集。

1.3.3 蛋白組分分析 采用SDS-PAGE分析高分子質(zhì)量蛋白，選擇分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％，脫脂奶上樣濃度約6 g/L，高分子質(zhì)量蛋白上樣濃度約為0.7 g/L，購買的β-乳球蛋白濃度約為2.5 g/L，100℃水浴處理5 min。電泳條件：濃縮膠為65 V恒壓，分離膠為135 V恒壓。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.4 IgE Western blot試驗 牛奶高分子質(zhì)量蛋白組分經(jīng)SDS-PAGE分離后，15 V恒壓干轉(zhuǎn)30 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用2％聚乙烯醇（PVA）4℃封閉過夜。從30例陽性血清中選取10例（1∶10）做一抗，用1例陰性血清做陰性對照，一抗4℃過夜。洗滌后加二抗（1∶300），37℃孵育2 h，洗滌后加底物液，37℃孵育10 min后終止反應(yīng)。

1.3.5 ELISA檢測過敏原特異性抗體 采用間接ELISA法檢測牛奶高分子質(zhì)量蛋白與30例陽性血清sIgE的結(jié)合情況，同時與牛奶主要過敏原β-乳球蛋白做比對。分別用牛奶高分子質(zhì)量蛋白組分和β-乳球蛋白包被96孔板，加入100 μL（1∶10稀釋）陽性血清和陰性血清，混合后37℃孵育2 h，洗滌5次后100 μL二抗（1∶2 000稀釋），37℃孵育30 min，洗滌5次后加入底物溶液，避光顯色15 min后加終止液終止反應(yīng)，并測定450 nm處的吸光度值（A450）。如測定孔A450＞2.1倍陰性對照A450則為陽性反應(yīng)，如測定孔A450＜2.1倍陰性對照A450則為陰性反應(yīng)。陽性反應(yīng)率=陽性反應(yīng)例數(shù)/總例數(shù)×100％。

2 結(jié)果

2.1 Sephadex G200凝膠層析分離 牛奶蛋白粗提液經(jīng)凝膠層析分離，出現(xiàn)了4個主要的蛋白峰，見圖1。第1個峰含有高分子質(zhì)量蛋白（暫命名為P1），收集并行SDS-PAGE分析。

Fig.1 Atlas of Sephadex G200 gel chromatography of whey protein圖1 乳清Sephadex G200凝膠層析圖

2.2 P1蛋白組分分析 P1組分主要包括3種高分子質(zhì)量蛋白，分子質(zhì)量從小到大依次為67、80和160 ku左右，參照文獻(xiàn)[8]推斷它們可能依次是牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白，見圖2。

Fig.2 SDS-PAGE analysis of milk extracts and HMW proteins圖2 牛奶蛋白粗提液和高分子質(zhì)量蛋白SDS-PAGE分析

2.3 P1組分與牛奶過敏陽性血清Wetern blot結(jié)果 10例陽性血清于P1分子質(zhì)量處均有反應(yīng)條帶，而1例陰性對照沒有明顯條帶。在80 ku和160 ku處出現(xiàn)深淺不一的可辨條帶，在67 ku附近條帶出現(xiàn)明顯條帶。以67 ku的陽性條帶最為明顯,見圖3。

2.4 ELISA檢測P1組分與牛奶過敏患者sIgE反應(yīng)結(jié)果 P1組分的陽性反應(yīng)率（46.7％）略高于β-乳球蛋白的陽性反應(yīng)率（43.3％）。

Fig.3 Immunoblotting analysis of milk HWM proteins圖3 牛奶高分子質(zhì)量蛋白印跡圖譜

3 討論

牛奶過敏是引起嬰幼兒及兒童食物過敏的最常見原因[9-10]。大多數(shù)的牛奶過敏是由IgE介導(dǎo)的，常用皮膚點刺試驗或血清學(xué)試驗來檢測牛奶過敏患者的特異性IgE[11]。因個體差異的因素，不同牛奶過敏患者識別的過敏原也不完全相同。因此，確認(rèn)牛奶主要過敏原組分尤為重要。

吳序櫟等[12]和Pourpak等[13]已經(jīng)對牛奶過敏原組分進(jìn)行了分離、純化和鑒定，但是研究重點是低分子質(zhì)量蛋白（≤34 ku），并未對牛奶高分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行研究。本課題組前期對牛奶過敏原組分進(jìn)行了分離、純化和鑒定，發(fā)現(xiàn)牛奶高分子質(zhì)量蛋白在牛奶過敏中可能起重要作用。因此，本研究重點對牛奶高分子質(zhì)量蛋白組分進(jìn)行了分離和致敏性鑒定。

本研究采用Sephadex G200凝膠層析對牛奶過敏原組分進(jìn)行了分離，得到的第1個蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛奶高分子質(zhì)量蛋白主要包括3種高分子質(zhì)量組分，分子質(zhì)量分別為67、80和 160 ku左右，推斷它們可能是牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白。本研究對牛奶高分子質(zhì)量蛋白的致敏性進(jìn)行了鑒定。經(jīng)Western blot分析，3種高分子質(zhì)量蛋白與牛奶過敏患者血清均呈陽性反應(yīng)，并且在67 ku附近條帶最明顯。經(jīng)ELISA分析，高分子質(zhì)量蛋白與牛奶過敏患者血清的陽性反應(yīng)率比β-乳球蛋白略高，充分說明牛奶高分子質(zhì)量蛋白具有較強的致敏性，也是牛奶中的重要過敏原。

本研究初步證實了牛奶高分子質(zhì)量蛋白在牛奶過敏中的重要致敏作用，為進(jìn)一步研發(fā)牛奶主要過敏原檢測試劑盒和牛奶過敏癥的診治提供了理論基礎(chǔ)。在本研究中，是把高分子質(zhì)量蛋白作為混合物來研究的，后續(xù)工作將進(jìn)一步分離純化混合蛋白，對單一過敏原組分的致敏性進(jìn)行研究。

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（2014-04-01收稿 2014-06-25修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Preliminary Research on the Milk Allergy Induced by High Molecular Weight Protein

HOU Liying1,ZHU Li’na1,LI Chan2,LIN Shuxiang2,LIU Tangyuheng1,YIN Yue1,LI Huiqiang1△
1College of Medical Laboratory,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China;2Tianjin Children’s Hospital
△

E-mail:lihuiqiang1965@163.com

ObjectiveTo investigate the allergization of milk high molecular weight proteins.MethodsThirty cases of patients with serum allergic to milk were selected.Their skin prick tests were positive.Resultsof serum specific IgE (sIgE)test were positive and≥1+.One case of healthy control with negative sIgE test and without history of allertgy,was included in this study.The serum samples were collected and frozen at-20℃.Sephadex G200 gel chromatography was used to obtain milk high molecular weight proteins.Western blot and ELISA methodswere used to detect milk high molecular weight proteins and the activity of serum sIgE.ResultsResultsof SDS-PAGE showed that high molecular weights proteins displayed by Sephadex G200 gel chromatography,mainly including three bands,the molecular weight of 67 ku,80 ku and 160 ku.Western blot analysis showed that three kinds of high molecular weights proteins can react with milk allergy serum, and the most obvious appeared near the molecular weight 67 ku band.ELISA analysis showed that the positive response rate of high molecular weight proteins with milk allergic patient’s serum was slightly higher than that of β-lactoglobulin(46.7％ and 43.3％,respectively).ConclusionThe milk high molecular weight protein components can induce specific IgE antibodies,which have important sensitization in the process of milk allergy.

food hypersensitivity;immunoglobulin E;Western blotting;enzyme-linked immunosorbent assay;milk; high molecular weight protein;allergization;specific IgE

R446

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.010

國家自然科學(xué)基金資助項目（81371882）

1天津醫(yī)科大學(xué)臨床免疫檢驗教研室（郵編300203）；2天津市兒童醫(yī)院

△通訊作者 E-mail：lihuiqiang1965@163.com