SDF-1/CXCR4對大腸癌細(xì)胞株SW480增殖、遷移及侵襲的影響及意義

袁麗倩 鄭淑芳

SDF-1/CXCR4對大腸癌細(xì)胞株SW480增殖、遷移及侵襲的影響及意義

袁麗倩1鄭淑芳2△

目的 探討基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)及其特異性受體CXC趨化因子受體4（CXCR4）對大腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移及侵襲能力的影響及意義。方法取對數(shù)生長期大腸癌細(xì)胞SW480分為對照組(未經(jīng)任何處理)、SDF-1組（加入100 μg/L SDF-1）、SDF-1＋AMD3100混合組(向細(xì)胞中加入1 mg/L AMD3100，孵育2 h后加入100 μg/L SDF-1)、AMD3100組（加入1 mg/L AMD3100）。免疫組化法檢測SW480細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)情況；RT-PCR法檢測SW480細(xì)胞中CXCR4 mRNA的表達(dá)情況，以及外源性SDF-1和AMD3100作用后CXCR4 mRNA表達(dá)水平的變化；MTT增殖實驗、Transwell遷移及侵襲實驗分別檢測SDF-1以及AMD3100對SW480細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果SW480細(xì)胞中CXCR4蛋白呈陽性表達(dá)（陽性率80％）。SW480細(xì)胞中有CXCR4 mRNA的表達(dá)，100 μg/L SDF-1促使CXCR4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)，且能被1 mg/L AMD3100阻斷。SDF-1組細(xì)胞增殖活性(0.847±0.039)高于對照組(0.624±0.011)和SDF-1＋AMD3100混合組(0.607±0.016)，AMD3100組(0.456±0.032)低于對照組和SDF-1＋AMD3100混合組(F=108.030，P＜0.05)。Transwell小室遷移及侵襲實驗中SDF-1組穿膜細(xì)胞數(shù)(個：98.7±5.8、33.7±6.2)均多于對照組(21.0±2.2、6.1±2.3)、SDF-1＋AMD3100混合組(18.5±8.4、8.5±2.8)和AMD3100組(12.1±3.2、2.1±1.0)，后3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論SDF-1/CXCR4生物軸可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞SW480的增殖、遷移及侵襲。

腸腫瘤；大腸；趨化因子CXCL12；受體,CXCR4；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運動；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；AMD3100

大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國惡性腫瘤中居4～5位。隨著人們生活環(huán)境、生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌發(fā)病率呈上升趨勢[1]。雖可采取手術(shù)、放化療、免疫等綜合治療措施，但其5年生存率依舊不高。研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制并進(jìn)行早期干預(yù)，對提高大腸癌臨床治療效果具有重要意義。研究顯示基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)及其特異性受體 CXC趨化因子受體 4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)在乳腺癌、肺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[2]。本課題組前期研究已證實大腸癌組織高表達(dá)CXCR4，其對大腸癌的發(fā)生以及浸潤轉(zhuǎn)移具有重要意義[3]，但有關(guān)其在大腸癌細(xì)胞中的作用報道尚少。本實驗選取大腸癌細(xì)胞株SW480作為研究對象，探討外源性SDF-1以及CXCR4特異性拮抗劑AMD3100干預(yù)后，大腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移及侵襲能力的改變，以揭示SDF-1/CXCR4軸在大腸癌細(xì)胞生物學(xué)活性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑與來源 人大腸癌細(xì)胞株SW480(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Transwell小室(美國Corning公司，小室膜孔徑為8.0 μm)，重組人SDF-1α(美國Peprotech公司，300-28A)，兔抗人CXCR4多克隆抗體(美國ABGENT公司，AT1696a-2F1)，AMD3100干粉(美國Sigma公司，A5602)，Matrigel膠(美國BD公司)，GAPDH 及CXCR4引物、RT-PCR試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大腸癌細(xì)胞株SW480用DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清在37℃、5％CO2、相對濕度90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 免疫組化法檢測大腸癌細(xì)胞株SW480中CXCR4蛋白的表達(dá) 在6孔板中制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞均勻爬滿玻片后行免疫組化染色：（1）無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次。（2）4％多聚甲醛在4℃條件下固定30 min。（3）3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min。（4）0.5％Triton孵育20 min后，加兔抗人CXCR4抗體37℃60 min。（5）二抗工作液37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液顯色，蘇木素復(fù)染后自來水返藍(lán)，顯微鏡下計數(shù)5個高倍視野中的陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽性率=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100％。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測SDF-1以及AMD3100作用前后大腸癌細(xì)胞SW480中CXCR4 mRNA的表達(dá) 采用完全隨機法將細(xì)胞分成4組：對照組（未經(jīng)任何處理）、SDF-1組（加入100 μg/L SDF-1）、SDF-1＋AMD3100混合組(先向細(xì)胞中加入1 mg/L AMD3100，孵育2 h后加入100 μg/L SDF-1)、AMD3100組（加入1 mg/L AMD3100）。提取各組總RNA，取相同濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并擴增，以GAPDH為內(nèi)參。CXCR4、GAPDH基因序列引物：CXCR4正義鏈5′-TGGCCTTATCCTGCCTGCCTGGTAT-3′，反義鏈5′-GGAGTCGATGCTGATCCCAAT-3′，擴增片段大小為173 bp；GAPDH正義鏈5′-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，反義鏈5′-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3′，擴增片段大小為104 bp。電泳后凝膠成像系統(tǒng)成像，測定各條帶灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測SDF-1以及AMD3100對大腸癌細(xì)胞SW480增殖活性的影響 將100 μL濃度為3×104個/mL SW480細(xì)胞單細(xì)胞懸液加入96孔板，24 h后細(xì)胞貼壁。按分組加藥后孵育24 h，繼而向各孔分別加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄除上清液。每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，于脫色搖床震蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm波長處測各孔光密度(OD)值。

1.2.5 Transwell遷移實驗檢測SDF-1以及AMD3100對大腸癌細(xì)胞SW480體外遷移能力的影響 將SW480細(xì)胞用含5％胎牛血清的培養(yǎng)液制成濃度為5×105個/mL的單細(xì)胞懸液，取100 μL接種于Transwell小室的上室。向下室加入0.6 mL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再向各實驗組下室分別加入SDF-1和AMD3100，每組均設(shè)3個復(fù)孔。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，用棉簽擦去膜上方表面的細(xì)胞，用4％多聚甲醛固定下室面細(xì)胞后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡(×200)下分別計數(shù)5個不同視野，取均數(shù)。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測SDF-1以及AMD3100對大腸癌細(xì)胞SW480體外侵襲能力的影響 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室的上室面，室溫風(fēng)干，其他操作步驟同遷移實驗。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去膜上方表面的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用4％多聚甲醛固定下室面細(xì)胞后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡(×200)下計數(shù)5個不同視野，取均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌細(xì)胞SW480免疫組化結(jié)果 SW480細(xì)胞胞膜和胞漿均著色，CXCR4蛋白陽性率為80％。見圖1。

2.2 SDF-1及AMD3100作用前后SW480細(xì)胞中CXCR4 mRNA表達(dá)水平 4組條帶所測得灰度值由高到低依次為：SDF-1組(1.652±0.046)、對照組(1.358±0.065)、SDF-1＋AMD3100混合組(0.937± 0.064)、AMD3100組(0.492±0.060)，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=218.942，P＜0.01)。見圖2。

2.3 SDF-1以及AMD3100作用下SW480細(xì)胞增殖活性的變化 各組OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 108.030，P＜0.05），其中SDF-1組(0.847±0.039)高于對照組(0.624±0.011)和SDF-1＋AMD3100混合組(0.607±0.016)，AMD3100組(0.456±0.032)低于對照組和SDF-1＋AMD3100混合組（均P＜0.05）；SDF-1＋AMD3100混合組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 SDF-1以及AMD3100作用下SW480細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲能力的變化 SDF-1組遷移細(xì)胞數(shù)均高于對照組、SDF-1＋AMD3100混合組和AMD3100組（均P＜0.05），后3組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。SDF-1組穿過Matrigel膠的SW480細(xì)胞數(shù)均高于對照組、SDF-1＋AMD3100混合組和AMD3100組（均P＜0.05），后3組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

Fig.1 CXCR4 positive expression by immunohistochemistry in SW480 cells(×200)圖1 SW480細(xì)胞CXCR4免疫組化陽性染色(×200)

Fig.2 The expression of CXCR4 mRNA in colorectal cancer cell line SW480 detected by RT-PCR圖2 RT-PCR檢測大腸癌細(xì)胞SW480 CXCR4 mRNA的表達(dá)

Tab.1 Changes of migration and invasion ability of SW480 colorectal cancer cells before and after SDF-1 and AMD3100 treatment表1 SDF-1及AMD3100作用前后SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化 (n=3,個,±s)

Tab.1 Changes of migration and invasion ability of SW480 colorectal cancer cells before and after SDF-1 and AMD3100 treatment表1 SDF-1及AMD3100作用前后SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化 (n=3,個,±s)

＊＊P＜0.01；a與SDF-1組比較，P＜0.05

組別對照組SDF-1組SDF-1＋AMD3100混合組AMD3100組F遷移細(xì)胞數(shù)21.0±2.2a98.7±5.8 18.5±8.4a12.1±3.2a169.076＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)6.1±2.3a33.7±6.2 8.5±2.8a2.1±1.0a46.539＊＊

3 討論

SDF-1又稱趨化因子CXCL12，是一種廣泛表達(dá)于多種組織的趨化因子。CXCR4是高度保守的G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體，作為SDF-1的特異性受體，其與SDF-1具有高度親和性，兩者特異性結(jié)合形成SDF-1/CXCR4軸是其生物學(xué)功能實現(xiàn)的分子基礎(chǔ)，與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移侵襲等密切相關(guān)[4]。目前越來越多的研究致力于揭示SDF-1/CXCR4軸對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，特別是其對惡性細(xì)胞的增殖、分化、定向遷移和侵襲方面的影響。AMD3100是CXCR4特異性受體阻滯劑，通過與CXCR4競爭結(jié)合位點，有效阻斷SDF-1結(jié)合CXCR4，從而抑制SDF-1/CXCR4軸在腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移中的作用。1 mg/L的AMD3100是阻止人類免疫缺陷病毒（HIV）進(jìn)入細(xì)胞的最佳濃度[5]，本研究以此濃度作為干預(yù)濃度。趨化因子受體常以一種獨特的、非隨機的方式存在于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，如大腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等[6-7]。本研究結(jié)果顯示SW480細(xì)胞中存在CXCR4蛋白以及CXCR4 mRNA的表達(dá)，表明SW480細(xì)胞表達(dá)CXCR4，可以此細(xì)胞株作為研究對象進(jìn)行后續(xù)實驗。外源性趨化因子SDF-1能夠從基因水平進(jìn)一步提高CXCR4 mRNA的表達(dá)，這一過程可被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100削弱。這與本課題組前期對大腸癌組織的研究結(jié)[2]以及耿華等[8]對肺癌的研究結(jié)果相一致。

有研究發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的細(xì)胞色素c是半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)重要的激活劑，SDF-1 與CXCR4特異性結(jié)合形成的SDF-1/CXCR4軸可激活PI3K/Akt信號通路以及MAPK/ERK1/2信號通路，促使抗凋亡基因BCL-2表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放，從而阻斷caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡途徑，無法正常發(fā)揮殺瘤效應(yīng)[9]；趨化因子SDF-1與受體CXCR4特異性結(jié)合可使G蛋白偶聯(lián)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，激活蛋白激酶B(PKB)，誘導(dǎo)促凋亡蛋白BDA磷酸化失活[10]；隨著腫瘤演進(jìn)，免疫系統(tǒng)最初的免疫監(jiān)視常被誘導(dǎo)成免疫耐受，免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮捍衛(wèi)作用[11]。有研究稱SDF-1在濃度為100～1 000 μg/L時顯現(xiàn)出最佳的刺激單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的效果[12]。本研究選用100 μg/L SDF-1作為誘導(dǎo)濃度，實驗證實100 μg/L SDF-1組細(xì)胞增殖活性較對照組明顯增強，而CXCR4特異性拮抗劑AMD3100又能削弱這一過程，提示CXCR4參與了SDF-1促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖的過程，SDF-1/CXCR4軸在SW480細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。這與Shen等[13]對胰腺癌的研究結(jié)果一致。

本研究的Transwell遷移、侵襲實驗結(jié)果顯示SDF-1組發(fā)生遷移、侵襲的細(xì)胞數(shù)均高于對照組、SDF-1＋AMD3100混合組和AMD3100組，提示100 μg/L SDF-1可促進(jìn)SW480細(xì)胞遷移、侵襲，這一過程又可被1 mg/L AMD3100阻斷。而單獨加入1 mg/L AMD3100、或按照100 μg/L SDF-1＋1 mg/L AMD3100混合組加藥，均不能抑制SW480細(xì)胞的遷移、侵襲。季世強等[14]對胰腺癌的體外研究顯示100 μg/L、1 mg/L AMD3100均可抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的遷移及侵襲，此結(jié)果與本實驗結(jié)果存在差異，可能是由于細(xì)胞種類、細(xì)胞不同代以及細(xì)胞密度之間的差異造成。SDF-1/CXCR4生物軸影響腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機制涉及調(diào)控腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)、通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透性[15]、上調(diào)乙酰肝素酶和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9[16]等以降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)整細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)增強腫瘤細(xì)胞的運動能力[17]等。體外研究證實SDF-1/CXCR4生物軸在大腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。SDF-1/CXCR4軸在體內(nèi)的作用情況有待進(jìn)一步研究。

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（2014-07-15收稿 2014-09-17修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects and Significance of SDF-1/CXCR4 in Proliferation,Migration and Invasion of Colorectal Cancer Cell Line SW480

YUAN Liqian1,ZHENG Shufang2△
1 Postgraduate Training Basement，2 Department of Pathology,Affiliated Hospital of Logistics College of CAPF,Liaoning Medical College,Jinzhou 300162,China
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E-mail:zhengshf@126.com

ObjectiveTo discuss the influence and significance of stromal cell-derived factor 1(SDF-1)and its specific receptor CXC chemokine receptor 4(CXCR4)in proliferation,migration and invasion ability of SW480 colorectal cancer cells.MethodsThe colorectal cancer cell line SW480 in logarithmic phase was divided into four groups:control group(with no any processing),SDF-1 group(added 100 μg/L SDF-1),SDF-1＋1 mg/L AMD3100 mixed group(added 1 mg/L AMD3100 for 2 hours,then added 100 μg/L SDF-1)and AMD3100 group(added 1 mg/L AMD3100).Immunohistochemistry method was used to detect the protein expression of CXCR4 in SW480 cells.The expression of CXCR4 mRNA in SW480 cells was detected by RT-PCR before and after SDF-1 and AMD3100 treatment.MTT assay and transwell chamber were used to test the changes of proliferation,migration and invasion ability of SW480 cells before and after SDF-1 and AMD3100 treatment.ResultsThe result of immunohistochemistry showed that CXCR4 protein was expressed in SW480 cells(positive rate=80％).CXCR4 mRNA was expressed in SW480 cells.The expression of CXCR4 mRNA was up-regulated by SDF-1(100 μg/L),which could be inhibited by AMD3100(1 mg/L).The proliferation activity was higher in SDF-1 group(0.847±0.039)compared to that in control group(0.624±0.011)and SDF-1＋AMD3100 mixed group(0.607±0.016). The proliferation activity was lower in AMD3100 group(0.456±0.031)than that in control group and SDF-1＋AMD3100 mixed group(F=108.03,P＜0.05).The number of transmembrane cells was more in SDF-1 group(98.7±5.8,33.7±6.2)than that in control group(21.0±2.2,6.1±2.3),SDF-1＋1 mg/L AMD3100 mixed group(18.5±8.4,8.5±2.8)and AMD3100 group (12.1±3.2,2.1±1.0)detected by transwell chamber experiment.However,there were no statistical differences between three groups.ConclusionThe biological axis SDF-1/CXCR4 can promote the proliferation,migration and invasion in colorectal cancer cell line SW480.

intestinal neoplasms;intestine,large;chemokine CXCL12;receptors,CXCR4;cell proliferation;cell movement;cell migration;cell invasion;AMD3100

R735.34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.002

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃面上項目（11JCYBJC13000）；武警后勤學(xué)院面上項目（WYMZ201009）

1遼寧醫(yī)學(xué)院武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地（郵編300162）；2病理科

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