第三代端粒酶缺失小鼠皮膚表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)特性觀察

張俊伶 黃 頌 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民

實(shí)驗(yàn)研究

第三代端粒酶缺失小鼠皮膚表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)特性觀察

張俊伶 黃 頌 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民△

目的 觀察第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）小鼠與野生型（WT）小鼠皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)目及功能差異。方法利用流式細(xì)胞術(shù)對皮膚表皮干細(xì)胞進(jìn)行數(shù)目分析及分選；實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測p21基因表達(dá)；表皮干細(xì)胞克隆形成數(shù)目檢測細(xì)胞自我更新能力。結(jié)果WT小鼠基底部表皮干細(xì)胞與基底部上層表皮干細(xì)胞比例分別為（9.56±1.06）％和（1.22±0.08）％，在G3Terc-/-小鼠中這兩部分細(xì)胞比例分別為（17.36±3.56）％和（2.92±0.72）％；G3Terc-/-小鼠p21相對表達(dá)水平為WT小鼠的6.4倍；WT小鼠每104個(gè)表皮干細(xì)胞能夠形成（280.20±29.81）個(gè)克隆，G3Terc-/-小鼠每104表皮干細(xì)胞僅能夠形成（29.28±5.24）個(gè)克隆，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠皮膚表皮干細(xì)胞出現(xiàn)衰老性的損傷。

小鼠,基因敲除；皮膚衰老；干細(xì)胞；端粒,末端轉(zhuǎn)移酶

當(dāng)今社會老齡化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，有關(guān)衰老及衰老相關(guān)疾病的分子機(jī)制的研究日益受到關(guān)注。衰老的標(biāo)志為器官萎縮、干細(xì)胞功能衰退、功能干細(xì)胞池耗竭等[1]。皮膚表皮干細(xì)胞能夠按照毛發(fā)生長循環(huán)周期生成新的毛發(fā)，也能在皮膚出現(xiàn)創(chuàng)傷時(shí)向上遷移，修復(fù)受損傷的表皮和皮脂腺，具有多種功能[2]。衰老的皮膚表現(xiàn)為膠原含量減少、彈性降低、干燥及褶皺增多、創(chuàng)傷修復(fù)能力減弱等，并可引起機(jī)體防御能力減弱及腫瘤易感性增加[3]。因此，研究皮膚表皮干細(xì)胞在衰老過程中的變化十分重要。端粒酶缺失小鼠模型是廣泛應(yīng)用的端?？s短引起衰老的小鼠模型。第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）及以上的端粒酶缺失小鼠表現(xiàn)出明顯的衰老相關(guān)特點(diǎn)[4]。p21基因表達(dá)增加是G3Terc-/-小鼠成體細(xì)胞衰老的特異性標(biāo)志[5]。筆者利用端粒酶缺失小鼠模型觀察衰老狀態(tài)下皮膚表皮干細(xì)胞變化，旨在研究皮膚表皮干細(xì)胞衰老及人類衰老過程中皮膚表皮干細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級G3Terc-/-小鼠及同窩對照的野生型（WT）小鼠各5只，40周齡，雄性，WT小鼠平均體質(zhì)量（30±1）g，G3Terc-/-小鼠平均體質(zhì)量（20±1）g，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器 無EDTA胰酶購自Gibco公司；CD49f-PE 和CD34-FITC抗體購自eBioscience公司；RNA提取試劑盒及cNDA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；p21熒光標(biāo)記探針和GAPDH熒光標(biāo)記探針購自ABI公司；表皮干細(xì)胞克隆形成培養(yǎng)基購自Cellntec公司；熒光定量PCR儀，ABI公司，型號7500；流式細(xì)胞儀，BD公司，型號AriaⅡ。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 皮膚表皮細(xì)胞分離 脫臼處死小鼠，將小鼠軀干皮膚用手術(shù)剪分離剪斷，參照文獻(xiàn)[6]中的方法分離獲取皮膚表皮細(xì)胞。

1.3.2 皮膚表皮干細(xì)胞抗體染色及流式細(xì)胞儀分選 將1.3.1中獲取到的1 mL皮膚表皮細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)樣本（WT與G3Terc-/-各5個(gè)樣本）5×106個(gè)細(xì)胞加入至1.5 mL離心管內(nèi)，再次以1 500 r/min離心5 min，去上清液。加入50 μL含0.5％BSA的PBS緩沖鹽溶液，然后分別加入CD49f-PE抗體4 μL和CD34-FITC抗體5 μL，冰上避光孵育1 h。孵育抗體結(jié)束后用5 mL含0.5％BSA的PBS緩沖鹽溶液洗2次，加入300 μL PBS進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選皮膚表皮干細(xì)胞。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測p21基因表達(dá) 流式細(xì)胞儀分選出5 000個(gè)基底部表皮干細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒及cNDA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA提取及cDNA合成。紫外分光光度計(jì)檢測合成后的cDNA濃度并將樣本調(diào)成相同濃度。取9 μL cDNA樣本，以GAPDH作為內(nèi)參，p21檢測組加入10 μL實(shí)時(shí)定量PCR混合試劑，1 μL p21熒光標(biāo)記探針；GAPDH檢測組加入10 μL實(shí)時(shí)定量PCR混合試劑，1 μL GAPDH熒光標(biāo)記探針。按照ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行基因表達(dá)檢測。檢測結(jié)果以2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算以觀察p21基因表達(dá)差異。

1.3.4 WT與G3Terc-/-小鼠皮膚表皮細(xì)胞克隆培養(yǎng) 胚胎成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)2 d，按照1.3.1中的方法獲取新生鼠皮膚表皮細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)表皮細(xì)胞接種至已有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板內(nèi)，加入2 mL表皮干細(xì)胞克隆形成培養(yǎng)基，隔天換液，培養(yǎng)7 d后計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)目比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠皮膚基底部表皮干細(xì)胞（CD49f-PE陽性同時(shí)CD34-FITC陽性細(xì)胞群）及基底部上層表皮干細(xì)胞（CD49f-PE陽性同時(shí)CD34-FITC陰性細(xì)胞群）比例明顯增多，見圖1、表1。

Fig.1 Representative image of epidermal stem cell flow cytometry圖1 表皮干細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析示意圖

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞比例比較（n=5，％，±s）

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞比例比較（n=5，％，±s）

＊＊P＜0.01

組別WT小鼠G3Terc-/-小鼠t基底部表皮干細(xì)胞比例9.56±1.06 17.36±3.56 4.690＊＊基底部上層表皮干細(xì)胞比例1.22±0.08 2.92±0.72 5.277＊＊

2.2 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞p21基因表達(dá)水平比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干細(xì)胞p21相對基因表達(dá)水平明顯增高，為WT小鼠的6.4倍，見圖2。

Fig.2 Relative expression of p21 level of epidermal stem cell in two groups of mice圖2 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞p21表達(dá)水平比較

2.3 2組小鼠表皮干細(xì)胞形成克隆能力比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-新生鼠皮膚表皮干細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少（[29.28±5.24）個(gè)/104vs（280.20± 29.81）個(gè)/104，t=18.533，P＜0.01]，克隆形成能力明顯下降，見圖3。

Fig.3 Microscope image of colonies obtained from isolated keratinocytes from two groups of mice(×4)圖3 2組小鼠皮膚表皮干細(xì)胞形成克隆顯微鏡下觀察圖（×4）

3 討論

3.1 皮膚表皮干細(xì)胞與毛發(fā)生長周期 毛發(fā)生長周期可分為生長期、退行期和休眠期。不同類型的表皮干細(xì)胞在毛發(fā)生長周期發(fā)揮著不同的作用。表皮干細(xì)胞可以通過對CD34和CD49f兩種抗原的檢測而分離開來，CD34和CD49f兩種抗原均高表達(dá)的基底部表皮干細(xì)胞是出現(xiàn)在休眠期的細(xì)胞，CD34高表達(dá)而CD49f低表達(dá)的基底部上層表皮干細(xì)胞是出現(xiàn)在生長期的細(xì)胞[2]。

3.2 衰老狀態(tài)下皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)目及功能變化 本研究顯示，與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干細(xì)胞和基底部上層表皮干細(xì)胞比例均明顯增加，p21基因相對表達(dá)水平提高，表皮細(xì)胞形成克隆數(shù)目顯著降低，每個(gè)克隆的體積顯著減小，說明在衰老狀態(tài)下，皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)目應(yīng)激性增加以應(yīng)對在衰老時(shí)出現(xiàn)的各種外部因素刺激。之前有研究提示，在外部因素刺激下，與WT小鼠相比G3Terc-/-小鼠表皮干細(xì)胞表現(xiàn)出動(dòng)員能力嚴(yán)重減弱和對增殖應(yīng)答反應(yīng)遲鈍[8]，提示增加的細(xì)胞數(shù)目并不能緩解衰老引起的表皮干細(xì)胞功能受損[9]。與以往研究一致的是，與年輕小鼠（2月齡的C57/BL6小鼠）相比，自然衰老小鼠（18月齡的C57/BL6小鼠）同樣出現(xiàn)皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)目增多及功能下降[10]，說明衰老確實(shí)引起皮膚表皮干細(xì)胞損傷。

3.3 本研究的意義 本研究通過對衰老模型小鼠皮膚表皮干細(xì)胞的研究，建立了表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，揭示了衰老小鼠表皮干細(xì)胞數(shù)目和功能變化以及衰老激活的相關(guān)信號通路變化，為衰老與表皮干細(xì)胞關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)，也為抗衰老相關(guān)藥物研發(fā)提供模型依據(jù)。

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（2013-12-30收稿 2014-03-03修回）

（本文編輯 李鵬）

Isolation and Culture of Epidermal Stem Cells from the Third Generation of Mice That Were Knocked-out of Terc

ZHANG Junling,HUANG Song,LU Lu,LI Deguan,WU Hongying,MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,the Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China MENG Aimin,E-mail：ai_min_meng@126.com

ObjectiveTo observe the difference in number of epidermal stem cell and its function between wildtype(WT)mice and the third generation of Terc knockout(G3Terc-/-)mice.MethodsFlowcytometry was used to analyse and sort epidermal stem cells;Quantitative real-time PCR is used to analyse the relative expression level of p21 in epidermal stem cells;Self-renewal ability was reflected by the number of colonies formed by epidermal stem cells.ResultsBasal and suprabasal ratios in epidermal stem cells in WT mice were(9.56±1.06)％and(1.22±0.08)％respectively;basal and suprabasal ratios in epidermal stem cell in G3Terc-/-mice were(17.36±3.56)％and(2.92±0.72)％respectively.Relative p21 expression level in G3Terc-/-mice was 6.40 fold to WT mice;Number of colonies formed by WT mice epidermal stem cells were(280.20±29.81)per 104cell,number of colonies formed by G3Terc-/-mice epidermal stem cells were(29.28±5.24)per 104cell,which present significant difference to each other（P＜0.05）.ConclusionCompared to WT mice,epidermal stem cells in G3Terc-/-mice were aging.

mice,knockout；skin aging；stem cells；telomerase

Q255

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.008

國家973重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2011CB964800-G）；國家自然科學(xué)基金海外合作基金（81129020）；國家自然基金面上項(xiàng)目（81072237,81372928）；天津市重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（11JCZDJC19100）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（20111106110038）

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300192)

△通訊作者 E-mail：ai_min_meng@126.com