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    測序技術(shù)在缺失型脊髓性肌萎縮癥基因診斷中的應(yīng)用

    2014-07-05 16:38:44孟英韜舒劍波
    天津醫(yī)藥 2014年7期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)含子攜帶者堿基

    孟英韜 舒劍波

    測序技術(shù)在缺失型脊髓性肌萎縮癥基因診斷中的應(yīng)用

    孟英韜 舒劍波

    目的探索將測序技術(shù)應(yīng)用于缺失型脊髓性肌萎縮癥(SMA)基因診斷的可行性。方法設(shè)計(jì)2對引物,PCR擴(kuò)增SMA致病基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(SMN1)與其同源基因SMN2之間5個(gè)不同堿基所在區(qū)域,第1對引物正向擴(kuò)增SMN1內(nèi)含子6至7間長度為501 bp片段,包含4個(gè)不同堿基位點(diǎn)g.31957、32006、32154及32269;第2對引物反向擴(kuò)增SMN1外顯子8區(qū)域,長度為189 bp,包含1個(gè)不同堿基位點(diǎn)g.32734。根據(jù)測序圖譜區(qū)分SMA患者與攜帶者和(或)正常人。將此方法應(yīng)用于7個(gè)臨床疑似SMA家系的診斷,并與聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法進(jìn)行比較。結(jié)果6例測序圖譜顯示SMN內(nèi)含子6至外顯子8之間5個(gè)SMN1和SMN2差異位點(diǎn)g.31957、32006、32154、32269及32734均只有SMN2特有堿基a、T、g、g和A,患兒父母(攜帶者)相同位點(diǎn)顯示為a/g、T/C、g/a、g/a和A/G。說明患者缺失SMN1基因,缺失范圍包括內(nèi)含子6至外顯子8;攜帶者則既有SMN1基因,又有SMN2基因,與患者能區(qū)分開。1例檢測結(jié)果為a、T、g、g和A/G,說明其缺失范圍不含外顯子8。測序法與PCR-RFLP方法結(jié)果一致。結(jié)論測序技術(shù)在缺失型SMA患者的基因診斷上優(yōu)于經(jīng)典PCR-RFLP法,更方便快捷,結(jié)果更明確,建議替代常用的PCR-RFLP法。

    脊髓性肌萎縮,兒童;序列分析,DNA;多態(tài)性,限制性片段長度;基因診斷;SMN基因

    脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是兒科最常見的常染色體隱性遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病之一,活嬰中發(fā)病率約(1~1.7)/10 000,攜帶者頻率約1/35~1/50[1]?;純杭顾枨敖铅良?xì)胞退行性變,四肢近端和軀干肌肉無力萎縮,嚴(yán)重者可致死。其致病原因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(survival motor neuron,SMN)缺失。人類SMN有SMN1和SMN2 2種高度同源拷貝,兩者僅有5個(gè)堿基差異,位于內(nèi)含子6至外顯子8之間。95%的SMA都存在SMN1外顯子7純合缺失,其余5%有基因內(nèi)點(diǎn)突變。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法在SMA基因診斷中應(yīng)用廣泛,沿用至今[2-3]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,測序技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床,本文設(shè)計(jì)2對引物將5個(gè)SMN1與SMN2不同位點(diǎn)包含其中,通過測序觀測5個(gè)位點(diǎn)是否均為SMN2基因所特有,探討此方法檢出SMA患者的可行性,為SMA基因診斷提供一新的途徑。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象2012年11月—2013年6月我院就診的7例臨床診斷疑似SMA患兒及其父母,男5例,女2例,年齡2個(gè)月~3歲,均簽署基因診斷知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本采集抽取患者及父母外周血2~3 mL,EDTA抗凝,鹽析法提取基因組DNA,溶解于TE液,DNA純度和濃度均經(jīng)核酸定量儀(Nanodrop 2000,美國)檢測,-70℃冰箱保存。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)參照GenBank中SMN1/SMN2基因序列(NG_008691.1、NG_00 8728.1),采用Gene Runner 3.04軟件設(shè)計(jì)引物1,擴(kuò)增長度501 bp,從SMN基因g.31844~g.32344,用于檢測SMN1/SMN2內(nèi)含子6與內(nèi)含子7之間4個(gè)不同位點(diǎn),分別位于g.31957、32006、32154、32269。SMN1/SMN2外顯子8的不同位點(diǎn)g.32734距以上4個(gè)位點(diǎn)距離較遠(yuǎn),故參考文獻(xiàn)[4]用引物2單獨(dú)擴(kuò)增,擴(kuò)增長度189 bp,從SMN基因g.32666~g.32854,由于差異位點(diǎn)距下游引物較遠(yuǎn),所以采用反向測序,引物序列見表1。SMN1基因g.31957、32006、32154、32269、32734這5個(gè)不同堿基位置的種類分別為g、c、a、a、G,SMN2基因5個(gè)不同堿基的種類分別為a、T、g、g、A(大寫寫字母代表位于外顯子,小寫字母代表位于內(nèi)含子)。

    Tab.1 Primers for identification of SMN1/SMN2表1 鑒別SMN1/SMN2引物

    1.2.3PCR擴(kuò)增采用60 μL反應(yīng)體系,基因組DNA用量約為250 ng。PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳,凝膠成像系統(tǒng)判定擴(kuò)增結(jié)果。

    1.2.4DNA測序委托金唯智生物技術(shù)公司完成。測序結(jié)果判定:正常人或攜帶者同時(shí)含有SMN1和SMN2,5個(gè)差異堿基位點(diǎn)g.31957、32006、32154、32269和g.32734顯示為a/g、T/C、g/a、g/a和A/G,而由于SMN1缺失造成的SMA患者僅有SMN2基因,在特定位置僅出現(xiàn)SMN2特有堿基,即僅顯示為a、T、g、g和A,由此可檢出缺失型SMA患者。

    1.2.5PCR-RFLP法位于SMN外顯子7的g.32006是基因診斷SMA關(guān)鍵位點(diǎn),此位點(diǎn)如沒有SMN1特異堿基C即可診斷為缺失型SMA;位于SMN外顯子8的g.32734對檢出SMN1外顯子8的缺失有輔助作用。PCR-RFLP法通過PCR與酶切兩個(gè)步驟檢測SMN外顯子7 g.32006與外顯子8 g.32734位點(diǎn)來檢出SMA患者。SMN外顯子7 g.32006的檢測:先用錯(cuò)配引物擴(kuò)增SMN外顯子7,再用限制性內(nèi)切酶DraⅠ將SMN2切成164和23 bp 2片段,SMN1缺乏DraⅠ酶切位點(diǎn)不能被酶切,SMN1缺失型患者電泳圖上僅出現(xiàn)SMN2被酶切后的164 bp條帶,攜帶者與正常人出現(xiàn)187和164 bp 2條帶。SMN外顯子8 g.32734的檢測:SMN2外顯子8序列存在DdeⅠ酶切位點(diǎn),SMN1無此酶切位點(diǎn),兩者可借此區(qū)分,電泳圖上出現(xiàn)188、125與63 bp 3條帶的SMN1的外顯子8不缺失,僅出現(xiàn)125 bp與63 bp 2條帶的SMN1的外顯子8缺失,詳見文獻(xiàn)[4]。

    2 結(jié)果

    2.1 患兒與攜帶者內(nèi)含子6 g.31957位點(diǎn)的差異患兒該位點(diǎn)為a,攜帶者為a/g,說明患兒該位點(diǎn)僅含SMN2基因,攜帶者既含SMN1又含SMN2基因,見圖1。

    Fig.1 Sequencing analysis of SMN g.31957 in intron 6圖1 SMN基因內(nèi)含子6 g.31957位點(diǎn)測序結(jié)果

    2.2 患兒與攜帶者外顯子7 g.32006位點(diǎn)的差異患兒該位置為SMN2基因所含的T,攜帶者該位置呈T/C,可以判定患兒此位置SMN1基因缺失,見圖2。

    2.3 患兒與攜帶者內(nèi)含子7 g.32154和g.32269位點(diǎn)的差異從測序圖譜中可看到患兒內(nèi)含子g.32154 和g.32269位點(diǎn)均為g,提示僅含SMN2基因,見圖3a、b;攜帶者g.32154和g.32269位點(diǎn)均為a/g,既含SMN1又含SMN2,見圖3c、d。說明患兒SMN1缺失區(qū)域包括內(nèi)含子7。

    Fig.2 Sequencing analysis of SMN g.32006 in exon 7圖2 SMN基因外顯子7 g.32006位點(diǎn)測序結(jié)果

    Fig.3 Sequencing analysis of SMN g.32154 and g.32269 in intron 7圖3 SMN基因內(nèi)含子7 g.32154和g.32269位點(diǎn)測序結(jié)果

    2.4 患兒與攜帶者外顯子8 g.32734位點(diǎn)的差異患兒反向測序圖譜此位點(diǎn)為T,說明僅含SMN2基因的A堿基;攜帶者反向測序圖譜為C/T,說明同時(shí)含SMN1和SMN2基因,由此判定患兒此位置SMN1基因缺失,見圖4。

    通過2段基因測序清楚顯示6例患兒SMN1在內(nèi)含子6至外顯子8區(qū)間發(fā)生缺失,5個(gè)位點(diǎn)均僅含SMN2基因;還檢出1例患兒g.32734反向測序圖譜為C/T,其余4點(diǎn)僅含SMN2基因,屬于SMN1外顯子7缺失但外顯子8不缺失患者。

    2.5PCR-RFLP法診斷SMA患兒與攜帶者的區(qū)別患兒SMN外顯子7經(jīng)DraⅠ內(nèi)切酶酶切后呈1條帶,攜帶者呈2條帶;患兒SMN外顯子8經(jīng)DdeⅠ內(nèi)切酶酶切后呈2條帶,攜帶者呈3條帶;見圖5。兩種方法均可將SMA患者與攜帶者區(qū)分開來,證實(shí)PCR-RFLP檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。

    Fig.4 Sequencing analysis of SMN g.32734 in exon 8圖4 SMN基因外顯子8 g.32734位點(diǎn)測序結(jié)果

    Fig.5 The electrophoresis of PCR-RFLP in molecular diagnosis of patients with SMA圖5 PCR-RFLP法診斷SMA患者電泳圖

    3 討論

    3.1 幾種SMA現(xiàn)有基因診斷方法比較SMA是發(fā)病率較高的神經(jīng)肌肉遺傳病,基因診斷方法是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。目前最新的基因診斷方法有MLPA[5]、DHPLC[6]及熒光定量PCR[7-8],這些方法雖然能檢出攜帶者,但由于價(jià)格昂貴、需要特殊儀器等原因,尚不適于臨床應(yīng)用,尤其是基層實(shí)驗(yàn)室。本院自2002年開展SMA基因診斷項(xiàng)目以來,一直采用PCRRFLP法,為近百例疑似者做過檢測。該方法使用錯(cuò)配引物,PCR效率可能受到影響,結(jié)果不夠穩(wěn)定;如遇酶活力降低、酶切不完全時(shí)可能出現(xiàn)假陰性;電泳圖譜目標(biāo)帶與對照帶僅相差20 bp,有時(shí)結(jié)果難于判定。

    3.2DNA測序技術(shù)的優(yōu)勢近年來基因測序技術(shù)發(fā)展迅速,從價(jià)格到時(shí)間逐步適合臨床應(yīng)用。本文依據(jù)SMA致病原因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)選取2對引物,通過擴(kuò)增結(jié)合測序,能清晰分辨SMN1外顯子7和(或)外顯子8純合缺失型SMA患者,由于采用5個(gè)位點(diǎn)的圖譜分析,提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度,避免了假陰性和假陽性。實(shí)驗(yàn)步驟簡便,僅需PCR擴(kuò)增與一代測序。曹延延等[9]采用類似方法僅對前4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測,不能檢測出外顯子7缺失但外顯子8不缺失的患者,此類患者雖占比例較小,但屬于SMN1轉(zhuǎn)化成SMN2造成的SMA,與純?nèi)笔偷腟MA致病機(jī)制不同,應(yīng)加以區(qū)分[9]。PCR-RFLP法僅能檢測外顯子7和(或)8是否發(fā)生缺失,無法了解缺失范圍是否涉及其他區(qū)域,而測序技術(shù)證實(shí)內(nèi)含子6及內(nèi)含子7也同時(shí)發(fā)生缺失,增加了對該病致病機(jī)制的了解。

    3.3 本方法局限性本方法不能區(qū)分正常人與攜帶者,因?yàn)閮烧咴?個(gè)標(biāo)志性位點(diǎn)均呈雜合狀態(tài),另一局限是對點(diǎn)突變或位于1~6號外顯子上的缺失造成的SMA無法檢出[10],這種類型在SMA患者中僅占約5%。

    總之,測序技術(shù)用于缺失型SMA的基因診斷是一種值得推廣并可以取代PCR-RFLP的方法。

    [1]Ben-Shachar S,Orr-Urtreger A,Bardugo E,et al.Large-scale population screening for spinal muscular atrophy:clinical implications[J]. Genet Med,2011,13(2):110-114.doi:10.1097/GIM.0b013e3182 017c05.

    [2]Zeng J,Lin Y,Yan A,et al.Establishment of a molecular diagnostic system for spinal muscular atrophy experience from a clinical laboratory in china[J].J Mol Diagn,2011,13(1):41-47.doi:10.1016/j. jmoldx.2010.11.009.

    [3]Liu WL,Li F,He ZX,et al.Molecular analysis of the SMN gene mutations in spinal muscular atrophy patients in China[J].Genet Mol Res,2013,12(3):3598-3604.doi:10.4238/2013.September.13.4.

    [4]Van der Steege G,Grootscholten PM,Van der Vlies P,et al.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy[J].Lancet,1995,345(8955):985-986.

    [5]He J,Zhang QJ,Lin QF,et al.Molecular analysis of SMN1,SMN2, NAIP,GTF2H2,and H4F5 genes in 157 Chinese patients with spinal muscular atrophy[J].Gene,2013,518(2):325-329.doi:10.1016/j. gene.2012.12.109.

    [6]Su YN,Hung CC,Li H,et al.Quantitative analysis of SMN1 and SMN2 genes based on DHPLC a highly efficient and reliable carrier-screening test[J].Human Mutation,2005,25(5):460-467.

    [7]Jiang W,Ji X,Xu Y,et al.Molecular prenatal diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophies using quantification polymerase chain reaction[J].Genet Test Mol Biomarkers,2013,17(5): 438-442.doi:10.1089/gtmb.2012.0481.

    [8]Alias L,Bernal S,Barcelo MJ,et al.Accuracy of marker analysis, quantitative real-time polymerase chain reaction,and multiple ligation-dependent probe amplification to determine SMN2 copy number in patients with spinal muscular atrophy[J].Genet Test Mol Biomarkers,2011,15(9):587-594.doi:10.1089/gtmb.2010.0253.

    [9]曹延延,瞿宇晉,宋昉,等.應(yīng)用基因組測序技術(shù)診斷缺失型脊肌萎縮癥[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2013,30(4):410-414.doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2013.04.007.

    [10]Thauvin-Robinet C,Drunat S,Saugier Veber P,et al.Homozygous SMN1 exons 1-6 deletion:pitfalls in genetic counseling and general recommendations for spinal muscular atrophy molecular diagnosis[J].Am J Med Genet A,2012,158A(7):1735-1741.doi: 10.1002/ajmg.a.35402.

    (2013-11-08收稿2014-02-18修回)

    (本文編輯李鵬)

    Sequencing Technology in Molecular Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy Caused by SMN1 Deletion

    MENG Yingtao,SHU Jianbo
    Pediatric Research Institute,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

    ObjectiveTo investigate the feasibility of DNA sequencing analysis in molecular diagnosis for spinal muscular atrophy(SMA).MethodsTwo pairs of primers were utilized to amplify the region including 5 different bases in SMA-causative gene SMN1 and its homologue copy SMN2 by polymerase chain reaction(PCR).The first primer amplified a fragment 501 bp long spanning from SMN intron 6 to intron 7 targeting four different bases(g.31957,32006,32154 and 32269).The second primer reversely amplified a 189 bp long fragment within SMN exon 8 including one base-pair difference(g.32734).PCR procedure was followed by Sanger sequencing technique to identify the 5 different bases.SMA patients caused by SMN1 homozygous deletion were distinguished from carriers or normal controls by absence of SMN1 specific bases in sequence chromatograms.This assay was performed in 7 SMA suspected patients and their parents.The specimens were also detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(RFLP)method.ResultsIt was found that 6 of 7 SMA suspected patients showed only SMN2 specific bases at the 5 different base positions among the region from intron 6 to exon 8,which meant the patient displaying only SMN2-specific nucleotide a,T,g,g and A at g.31957,32006,32154,32269 and 32734,while their parents(carriers)showed a/g,T/C,g/a,g/a and A/G at the same sites.SMN1 gene was deleted in the patient,and the deletion region was inferred from intron 6 to exon 8.Because carriers had both SMN1 and SMN2 genes,they can be discriminated from the SMN1 deleted patient.One of 7 patients yield an unique sequence chromatogram of a,T,g,g and A/G,indicating that exon 8 of SMN1 was not deleted in this patient.ConclusionDNA sequencing analysis is an alternative simple method for detecting SMA caused by homozygous deletion of SMN1.We recommend to replace the widely used PCR-RFLP method with DNA sequencing assay.

    spinal muscular atrophies of childhood;sequence analysis,DNA;polymorphism,restriction fragment length;genetic testing;SMN gene

    R746.4,R725.962

    A

    10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.021

    天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目(2011KZ34)

    天津市兒童醫(yī)院兒科研究所(郵編300074)

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