多西環(huán)素對(duì)乳腺癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響

趙蘊(yùn)珍 李佳怡

多西環(huán)素對(duì)乳腺癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響

趙蘊(yùn)珍 李佳怡

目的通過檢測(cè)多西環(huán)素對(duì)小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCML-TAⅡ99）中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)蛋白表達(dá)水平，揭示其對(duì)該腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。方法建立BCML-TAⅡ99模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)MMP-9和TIMP-1蛋白在多西環(huán)素給藥組與對(duì)照組腫瘤組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。結(jié)果與對(duì)照組相比，給藥組腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組；MMP-9蛋白在給藥組表達(dá)下調(diào)，而TIMP-1蛋白表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且MMP-9與TIMP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論多西環(huán)素可通過調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)水平，對(duì)BCML-TAⅡ99模型中腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用。

多西環(huán)素；乳腺腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；肺；基質(zhì)金屬蛋白酶9；金屬蛋白酶類組織抑制劑；小鼠,近交系;乳腺癌

乳腺癌因較高的發(fā)病率和病死率已成為嚴(yán)重危及人類生命的惡性腫瘤之一。影響乳腺癌預(yù)后的因素很多，而癌細(xì)胞是否發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是判定患者預(yù)后的重要臨床指標(biāo)。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解與乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在其降解過程中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的作用尤為重要。作為MMPs的廣譜抑制劑，多西環(huán)素的抗腫瘤作用越來越被關(guān)注[1]。本研究采用小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCMLTAⅡ99）進(jìn)行多西環(huán)素給藥實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)腫瘤組織MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)蛋白的表達(dá)水平，探討該藥對(duì)乳腺癌組織生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康清潔級(jí)津白Ⅱ(TAⅡ)近交系雌性小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量18.0～21.8 g，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCML-TAⅡ99）由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所提供。（2）免疫組織化學(xué)試劑。TIMP-1、MMP-9兔抗人、大鼠、小鼠多克隆抗體及二抗，均為工作液，購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及實(shí)驗(yàn)分組運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化的分組方法，將小鼠分為對(duì)照組和給藥組，各15只。第92代BCML-TAⅡ99瘤株傳代小鼠頸椎離斷處死，無菌條件下取腫瘤組織剪碎至2 mm3，生理鹽水清洗，分別接種于小鼠左側(cè)乳腺區(qū)域。接種結(jié)束后小鼠回籠，每日觀察。于小鼠皮下出現(xiàn)可觸及腫塊后次日開始給藥，對(duì)照組每天腹腔注射0.1 mL生理鹽水，給藥組每天腹腔注射鹽酸多西環(huán)素0.1 mL (10 g/L)，共7周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，完整剖取腫瘤及肺組織稱質(zhì)量并沿最大徑線剖開，于10％福爾馬林常規(guī)固定、石蠟包埋切片。HE染色切片鏡下觀察有無肺轉(zhuǎn)移。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定采用免疫組織化學(xué)兩步法染色，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，每次染色選擇已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。TIMP-1和MMP-9陽(yáng)性染色細(xì)胞為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片先在低倍鏡（× 100）下觀察整體染色情況，避開壞死區(qū)域選取10個(gè)代表區(qū)（即切片的上、下、左、右、中央各2個(gè)區(qū)域），高倍鏡（×400）下每區(qū)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：每張切片上計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5％為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5％為陽(yáng)性。個(gè)別壞死嚴(yán)重的切片不足10個(gè)高倍視野按實(shí)際視野數(shù)計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher’s確切概率法；相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多西環(huán)素對(duì)小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型肺轉(zhuǎn)移率的影響實(shí)驗(yàn)過程中給藥組小鼠一般狀況較對(duì)照組好，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，剖開胸腔，肺組織表面及切面可見白色半透明狀小結(jié)節(jié)，無胸腔積液。HE染色鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示，給藥組肺轉(zhuǎn)移率均低于對(duì)照組，見表1。

Tab.1 Effects of doxycycline on tumor metastasis and the expressions of MMP-9 and TIMP-1表1 多西環(huán)素對(duì)轉(zhuǎn)移情況和MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)的影響（n=15）

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)情況及兩者的相關(guān)性MMP-9和TIMP-1陽(yáng)性為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，見圖1、2。給藥組MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，而TIMP-1表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（均P＜0.05），見表1。MMP-9與TIMP-1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.627，P＜0.01）。

Fig.1 The expression of MMP-9 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）圖1 MMP-9在腫瘤組織表達(dá)（免疫組化，×400）

Fig.2 The expression of TIMP-1 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）圖2 TIMP-1在腫瘤組織表達(dá)（免疫組化，×400）

3 討論

乳腺癌侵襲性行為受諸多因素的影響，涉及多個(gè)步驟，首先腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞表面受體黏附到ECM層黏蛋白上；其次，蛋白水解酶前體釋放活化，破壞由細(xì)胞間質(zhì)及基底膜構(gòu)成的ECM，主要是對(duì)Ⅳ型膠原的水解；最后，腫瘤細(xì)胞穿過ECM進(jìn)入局部淋巴系統(tǒng)及毛細(xì)血管，在遠(yuǎn)隔部位突破毛細(xì)血管形成轉(zhuǎn)移。此過程如果缺乏有效降解Ⅳ型膠原的酶，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程將會(huì)終止。郭玉芳等[2]研究表明乳腺癌腫瘤細(xì)胞周圍可出現(xiàn)活化的明膠酶（包括MMP-2和MMP-9），而正常乳腺組織中則未見其活化，提示乳腺癌可通過誘導(dǎo)MMPs活化來實(shí)現(xiàn)其早期侵襲行為。Lebeau等[3]研究顯示，乳腺癌標(biāo)本中MMP-9有較高水平表達(dá)，且MMPs在乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)的邊緣部位表達(dá)增強(qiáng)，與腫瘤侵襲生長(zhǎng)的生物型特性相符合。劉玲莉等[4]研究表明MMP-2、MMP-9表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、病理類型及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

TIMPs是MMPs的天然抑制物，作為MMP-9的天然抑制物，TIMP-1通過與MMP-9形成1∶1的復(fù)合物抑制其活性，有研究表明MMPs與TIMPs表達(dá)水平失衡與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。亦有研究顯示多西環(huán)素可以通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs表達(dá)水平，抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)[6]。多西環(huán)素屬于化學(xué)修飾的四環(huán)素類藥物（CMTs），其特異性的增強(qiáng)抗MMPs作用，減弱抗生素作用，已成為外源性的廣譜MMPs抑制劑，因其長(zhǎng)期口服不良反應(yīng)小，小劑量即可維持較高血藥濃度，如果能在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮一定作用，將有廣泛的臨床應(yīng)用前景。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，多西環(huán)素能抑制MMP-2、MMP-9的合成及活性[7]。本研究結(jié)果顯示，MMP-9表達(dá)于乳腺癌腫瘤細(xì)胞胞漿中，且在腫瘤細(xì)胞侵襲邊緣密集，而給藥組表達(dá)水平相對(duì)較低；此外給藥組TIMP-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組增高，提示多西環(huán)素可抑制乳腺癌腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達(dá)，增加TIMP-1的表達(dá)。同時(shí)，給藥組小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率低于對(duì)照組，提示多西環(huán)素可能通過參與調(diào)解MMP-9/TIMP-1的失衡，實(shí)現(xiàn)抑制乳腺癌組織的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。

[1]Zhou HE,Nothnick WB.The relevancy of the matrix metalloproteinase system to the pathophysiology of endometriosis[J].Front Biosci, 2005,10:569-575．

[2]郭玉芳，梅紅，李一雷，等.DQ明膠原位酶譜分析方法在檢測(cè)乳腺癌組織中明膠酶活性的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志，2007,36（4）：274.

[3]Lebeau A,Muller-Aufdemkamp C,Allmacher C,et al.Cellular protein and mRNA expression patterns of matix metalloproteinases2,3 and 9 in human breast cancer:correlation with tumor growth[J].J Mol Histol,2004,35(5):443-455.

[4]劉玲莉,朱德茂.乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)與其預(yù)后的相關(guān)性[J].實(shí)用癌癥雜志，2010，25（3）：300.

[5]孫淑文，王玉亭，王道奎,等.MMP-2,MMP-9,TIMP-1和Timp-2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,33(1)：16-18.

[6]孫保存，張?jiān)娢洌R麗莎，等．內(nèi)皮抑素和多西環(huán)素抑制黑色索瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的研究[J]．中華病理學(xué)雜志，2006，35 (11)：677-680．

[7]Shen LC,Chen YK,Lin LM,et al.Anti-invasion and anti-tumor growth effect of doxycycline treatment for human oral squamouscell carcinoma-In vitro and in vivo studies[J].Oral Oncology, 2010,46(3):178-184.

（2013-10-25收稿2014-01-14修回）

（本文編輯李國(guó)琪）

Effects of Doxycycline on Tumor Growth and Metastasis in Breast Cancer Xenografts in Mice

ZHAO Yunzhen，LI Jiayi
Tianjin Medical College,Tianjin 300222,China

ObjectiveTo investigate the effects of doxycycline on the expressions of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)and tissue inhibitor of metaloproteinase-1(TIMP-1)in breast cancer lung metastasis model mice(BCML-TAⅡ99),and the mechanism thereof.MethodsThe BCML-TAⅡ99 mouse model was established.The immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of MMP-9 and TIMP-1 in BCML-TAⅡ99 model mice and controls．ResultsThe metastasis rate was significantly lower in treatment group than that of control group.The expression of MMP-9 was significantly reduced,but the expression of TIMP-1 was significantly increased,in treatment group compared with those of control group(P＜0.05).ConclusionDoxycycline can inhibit tumor growth and metastasis in breast cancer with 1ung metastasis model mice by regulating MMP-9 and TIMP-1 expressions．

doxycycline;breast neoplasms;neoplasm metastasis;lung;matrix metalloproteinase 9;tissue inhibitor of metalloproteinases;mice,inbred strains;breast cancer

R737.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.012

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20060124）

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