1株聚磷菌株的鑒定及其積累聚–β–羥基丁酸酯的條件

趙美，金子靖，李博，劉哲君，趙敏，孫藝萍

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

1株聚磷菌株的鑒定及其積累聚–β–羥基丁酸酯的條件

趙美，金子靖，李博，劉哲君，趙敏*，孫藝萍

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

從SBR活性污泥中篩選、分離出1株有聚–β–羥基丁酸酯(PHB)積累能力的聚磷細(xì)菌（將其命名為“LB4”），通過形態(tài)、生理生化及16S rDNA方法分析，鑒定該聚磷細(xì)菌為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)。采用厭氧、好氧交替培養(yǎng)方法，研究影響其積累聚–β–羥基丁酸酯 (PHB)的因素。結(jié)果表明：在厭氧初始階段，當(dāng)pH為8.0，COD 為2 000 mg/L，培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，通過批式補(bǔ)料方式短期限制磷元素對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，最有利于該菌株積累PHB，PHB的最高積累量可達(dá)菌體干重的32.6%。

聚磷細(xì)菌；聚–β–羥基丁酸酯 (PHB)；鮑曼不動(dòng)桿菌

聚–β–羥基丁酸酯(PHB)是許多細(xì)菌利用不平衡營養(yǎng)供給物生長時(shí)產(chǎn)生的碳源類貯藏物[1]，因具有不可替代的生物可降解性、生物相容性和壓電性，被用于生產(chǎn)優(yōu)良的生物降解塑料、生物相容性材料和環(huán)保高分子材料[2–3]，在農(nóng)業(yè)、食品業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[4–5]，但其廣泛應(yīng)用受到高生產(chǎn)成本的限制。馬忠友等[6]以工廠污水為原料，利用絲狀細(xì)菌生產(chǎn)PHB，PHB含量達(dá)細(xì)胞干重的37.24%，不僅大大降低了PHB的生產(chǎn)成本，還使污泥得到了合理利用。調(diào)節(jié)活性污泥中溶解氧的濃度，可使PHB含量由26%提高到37%[7]。以食品工業(yè)廢水為原料，通過優(yōu)化碳氮比，PHB含量可達(dá)到菌體干重的33%[8]。聚磷菌是污水處理中起脫氮除磷作用的主要菌群。PHB作為活性污泥中聚磷菌細(xì)胞內(nèi)積累的能源物質(zhì)，在生物除磷過程中起著“能量轉(zhuǎn)換器”的關(guān)鍵作用[9]。如果能利用脫磷工藝剩余污泥中的聚磷菌群來累積PHB，不僅能節(jié)省大量發(fā)酵培養(yǎng)菌群的費(fèi)用，還可為剩余污泥的處置提供新方法。筆者以1株從活性污泥中獲得的具有PHB合成能力的聚磷菌為對(duì)象，研究其積累PHB的部分影響因素，旨在為實(shí)現(xiàn)剩余污泥的資源化和降低PHB生產(chǎn)成本提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

取哈爾濱文昌污水處理廠的活性污泥，通過序批式活性污泥法馴化，待其成熟后進(jìn)行分離、純化，獲得菌株。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及培養(yǎng)基和模擬廢水的配制

將保存的菌株經(jīng)斜面活化后，采用厭氧、好氧序批式活性污泥法[10]培養(yǎng)，所得菌體用于測(cè)定菌體干重和PHB積累量。

斜面培養(yǎng)基的配制：稱取酵母膏10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，(NH4)2SO45 g，瓊脂20 g，加入1 L蒸餾水，調(diào)pH至7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基的配制：稱取牛肉膏 8 g，胰蛋白胨5 g，NaCl 5 g，葡萄糖1 g，加入1 L蒸餾水，調(diào)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

自配模擬廢水：稱取CH3COONa 1 335 mg，(NH4)2SO4280 mg，K2HPO4·3H2O 75 mg，NaCl 220 mg，CaCl2125 mg，MgSO4·7H2O 27 mg，F(xiàn)eCl3·3H2O 10 mg，加入1 L蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的鑒定

菌株的形態(tài)、生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[11–12]。

用16S rDNA測(cè)序進(jìn)行分類學(xué)鑒定。參照文獻(xiàn)[13]，PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA。運(yùn)用Clustal.X1.8.1軟件進(jìn)行DNA序列同源性比較，比對(duì)結(jié)果采用Vector NTI軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 影響菌株合成PHB能力的因素研究

以乙酸為碳源，在30 ℃條件下，研究初始pH、培養(yǎng)溫度、初始COD濃度、營養(yǎng)條件對(duì)菌株生長及PHB積累的影響。

1.2.4 PHB的表征分析

PHB定量測(cè)定：按照文獻(xiàn)[14]得到PHB產(chǎn)品，采用Law等的方法[15–16]測(cè)定樣品中的PHB含量，用不含PHB的氯仿作空白對(duì)照。

元素分析：用元素分析儀(VarioEL Ⅲ型，德國Bruker公司)分析所提取樣品中C、H元素的含量(質(zhì)量百分比)。

紫外吸收光譜分析：在波長180～300 nm測(cè)定光密度。

紅外光譜表征：在光譜分辨率2 cm–1下，于4 000～400 cm–1進(jìn)行紅外光譜(傅立葉變換紅外光譜儀，AVATAR–360，美國Nicole公司)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚磷菌株的鑒定結(jié)果

菌落為圓形，中央較厚，邊緣圓整，呈淡黃色，不透明，表面光滑；菌株不具有運(yùn)動(dòng)性，無鞭毛；革蘭氏陰性，無芽孢；掃描電鏡下觀察菌體呈球桿狀，兩端鈍圓，細(xì)胞大小為(0.9～1.6) μm×(1.5～2.5) μm(圖1)。菌株的生理生化特性見表1。

圖1 菌株的電鏡觀察結(jié)果(×20 000)Fig. 1 Electron micrograph of the strain (×20 000)

表1 菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain

菌株 16S rDNA 序列分析結(jié)果(圖2)表明，該聚磷菌與序列號(hào)為EU760628和EU760625的不動(dòng)桿菌屬菌株的同源性高達(dá)99%。結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，鑒定菌株LB4為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)，并命名為Acinetobacter baumannii LB4。

圖2 LB4菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain LB4

2.2 聚磷菌合成PHB能力的影響因素

2.2.1 pH對(duì)合成PHB能力的影響

由表2可以看出，初始pH 8.0最利于LB4積累 PHB，積累量達(dá) 229.6 mg/L，占細(xì)胞干重的19.2%。可見，控制初始pH微堿性，對(duì)A. baumannii LB4合成PHB有利。

表2 不同條件下LB4的菌體(1 L)的干重和PHB質(zhì)量Table 2 Strain dry weight and PHB mass under 1 L of LB4 with different conditions

2.2.2 溫度對(duì)合成PHB能力的影響

由表2可知，培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，PHB濃度達(dá)到最大值(268.1 mg/L)，同時(shí)，PHB占細(xì)胞干重的比率也達(dá)到最大值(21.2%)；當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，兩者均呈急劇下降趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟壬?，菌株?xì)胞的生長速率和代謝活動(dòng)隨之增加，但當(dāng)溫度高到一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)酶活性降低等現(xiàn)象，從而使細(xì)胞代謝功能急劇下降，影響菌體的生長和 PHB的積累。

2.2.3 碳源濃度對(duì)合成PHB能力的影響

由表2可知，初始COD4 000系統(tǒng)內(nèi)的PHB積累量最大，為623.6 mg/L，但其積累的PHB(占細(xì)胞干重的24.9%)較COD2 000系統(tǒng)的(27.6%)少，這是由于COD4 000的細(xì)胞濃度較大，所以，采用COD 為2 000的碳源濃度最有利于積累PHB。

2.2.4 營養(yǎng)條件對(duì)合成PHB能力的影響

由表2可知，營養(yǎng)條件改變后，經(jīng)過9 h的厭氧反應(yīng)，氮磷限制、磷限制、氮限制條件下的PHB積累量均較營養(yǎng)平衡情況下有所增加，其中，短期磷限制最利于提高PHB的積累。

2.3 PHB的表征分析結(jié)果

對(duì)所提取的 PHB樣品的元素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，元素 C、H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 56.66%和7.19%，而PHB中元素C、H的理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.81%和7.02%，可見，樣品測(cè)定值與理論計(jì)算值的相對(duì)誤差較小。

由圖3可見，所提取的PHB樣品在225 nm處有強(qiáng)吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的峰十分接近， 純度較高。

由圖4可見，所提取的樣品在1 724 cm–1處有強(qiáng)吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰較一致(此峰為PHB的羰基吸收峰[17])，說明樣品中含有PHB。

圖3 PHB樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜分析結(jié)果Fig.3 UV absorption spectra of PHB sample and reference substance

圖4 PHB標(biāo)準(zhǔn)品和提取樣品的紅外光譜分析結(jié)果Fig. 4 Infrared spectra of PHB reference substance and PHB sample

3 結(jié)論與討論

微生物的生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝都與 pH密切相關(guān)。pH值的變化會(huì)引起細(xì)胞膜電荷的變化和代謝過程中酶活性的變化，從而影響到微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[18]。目前，關(guān)于pH對(duì)SBR系統(tǒng)影響的研究多數(shù)是通過批式試驗(yàn)全程控制pH進(jìn)行的，但全程控制pH在實(shí)際運(yùn)行過程中并不容易實(shí)現(xiàn)，pH通常隨著反應(yīng)的進(jìn)行而改變，全程控制pH得出的結(jié)論只能反映pH沖擊負(fù)荷對(duì)系統(tǒng)的影響，而不能反映系統(tǒng)穩(wěn)定的運(yùn)行狀態(tài)。本試驗(yàn)中通過控制起始pH考察穩(wěn)定運(yùn)行的PHB積累系統(tǒng)受pH的影響，結(jié)果表明，初始pH 8.0最利于LB4積累PHB，積累量達(dá)229.6 mg/L，所以控制初始pH微堿性，對(duì)A. baumannii LB4合成PHB有利。這與Dionisi的研究結(jié)果[19]相符。

聚磷菌在好氧條件下正常生長，所吸收的有機(jī)物用來合成蛋白質(zhì)、核酸等新的細(xì)胞物質(zhì)和PHB、糖原、多聚磷酸鹽等儲(chǔ)藏性物質(zhì)。為了提高胞內(nèi)PHB的積累量，必須使細(xì)胞將所吸收的有機(jī)物盡可能地轉(zhuǎn)化為PHB，減少其他物質(zhì)的合成，因此，限制N、P等提供條件，使菌體中非PHB成分的生成減少，理論上能提高PHB的含量[20]。本試驗(yàn)中短期磷限制最有利于提高菌株LB4對(duì)PHB的積累量。這與王婧等[21]的研究結(jié)論相符。通過營養(yǎng)平衡主體反應(yīng)器馴化，得到能夠正常生長并積累PHB較多的微生物種群，再采用批式補(bǔ)料方式短期限制營養(yǎng)條件對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)處理，更有利于PHB的積累。

利用聚磷菌純培養(yǎng)合成 PHB離實(shí)際應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)還存在較大距離。將具有積累 PHB的不同聚磷菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，或采用廢水除磷工藝剩余活性污泥中的聚磷菌群直接積累生產(chǎn)PHB，均具有很強(qiáng)的可行性，有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Identification of a phosphate-accumulating bacteria strain and influencing factors on poly-β-hydroxybutyrate accumulation

ZHAO Mei, JIN Zi-jing, LI Bo, LIU Zhe-jun, ZHAO Min*, SUN Yi-ping
(College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

LB4, a phosphate-accumulating strain with the ability of poly–β–hydroxybutyrate(PHB) granules accumulation, was isolated from activated sludge of SBR in treatment equipment of wastewater. Through the analysis from morphological, biochemical characteristics, and identification using 16S rDNA sequence approach, LB4 was proved to be a subspecies of Acinetobacter baumannii. The influence factors for PHB accumulation were investigated by alternative cultivation of anaerobic-aerobic cycle. The results showed that the favourite conditions for the strain to accumulate PHB at the beginning of anaerobic phase was at temperature 35 ℃, pH 8.0, COD 2 000 mg/L, and with short-term phosphorus inhibition, the maximum accumulation of PHB could reach to that of 32.6% dry weight of the strain.

phosphate-accumulating bacteria; poly-β-hydroxybutyrate (PHB); Acinetobacter baumannii

S216.3

A

1007?1032(2014)02?0202?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.019

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–01–04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(J1210053)

趙美(1987—)，女，山東省泰安市人，碩士研究生，主要從事污染物降解微生物學(xué)研究，zmzr2009@163.com，*通信作者，82191513 @163.com。金子靖同為第一作者。