匍枝根霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基優(yōu)化研究

湯文晶，謝志皓，張慶慶，鄭天柱，真 超

（安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

研究利用農(nóng)副產(chǎn)品為主要碳源，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶，提高農(nóng)副產(chǎn)品的利用率.木聚糖酶［1－2］是指能夠降解半纖維素木聚糖生成木寡糖和木糖的一組酶的總稱，主要是由β－1，4－D－內(nèi)切木聚糖酶和β－1，4－D－外切木糖苷酶組成.隨著微生物工程技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外利用不同菌種來發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶.國(guó)內(nèi)主要以黑曲霉、里氏木霉及綠色木霉為生產(chǎn)菌株，通過不同的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化產(chǎn)生木聚糖酶，獲得較高的產(chǎn)量，并應(yīng)用于食品及工業(yè)；國(guó)外通過基因工程技術(shù)獲得木聚糖酶基因，Dorra Driss等［3－5］通過提取青霉菌中的木聚糖酶基因，通過異源表達(dá)以及分離純化，獲得純酶，César Rafael利用甘蔗渣、木薯片等優(yōu)化培養(yǎng)基，獲得較高的酶活.木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，除了在造紙和紙漿工業(yè)領(lǐng)域外［6］，木聚糖酶作為面包烘焙添加劑，可改善面包的彈性和硬度［7］；添加木聚糖酶有助于小麥啤酒的過濾，增加啤酒酒香［8］等.

利用TP－02匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉，采用深加工農(nóng)副產(chǎn)品為主要碳源，以成本低廉、來源豐富的玉米芯和麥麩作為原料，采用微生物液態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)木聚糖酶，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定影響木聚糖酶酶活的主要因素和添加量，根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，并借助Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，木聚糖酶酶活得到較大提高，利用此方法生產(chǎn)木聚糖酶作為食品添加劑，為低成本利用生物質(zhì)資源技術(shù)提供有利依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉（Rhizopus stolonifer var.reflexus TP－02），分離自黃山生態(tài)林腐木.木聚糖：樺木木聚糖（Sigma）；其他試劑均為國(guó)藥分析純.

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

菌種活化：將匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉在PDA斜面上30℃培養(yǎng)3～5d，4℃保存?zhèn)溆?

種子液培養(yǎng)：將活化好的菌株用無菌水洗下孢子用玻璃珠分散菌落，接入100mL 10%麥麩浸出汁（體積250mL三角搖瓶中）的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，恒溫培養(yǎng)24h.

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥麩4g，（NH4）2SO40.2g，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.2%，吐溫－80 0.025%，微量元素液1%，滅菌后接種，在30℃，180r/min培養(yǎng).

1.3 試劑配制及木聚糖酶測(cè)定方法

木糖標(biāo)準(zhǔn)液配制：配制濃度為1mg/mL.1%的木聚糖水解底物：取1%木聚糖用0.2mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）溶解；微量元素液：FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2.DNS顯色液、木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、木聚糖酶酶的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［9］，以每分鐘每毫升酶液釋放1umol木糖的量為1個(gè)酶活力單位（U·mL－1）.酶活計(jì)算公式：（X·103）/（M·T·V）IU/mL.其中，X為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的含糖量，mg；M為相對(duì)分子質(zhì)量（木糖的相對(duì)分子質(zhì)量為150.13）；T為反應(yīng)時(shí)間，min；V為粗酶液體積，mL.

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以農(nóng)副產(chǎn)品下腳料為碳源；以 NaNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、CO（NH2）2為氮源；以 KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、Na2HPO4、FeSO4、MnSO4為無機(jī)鹽；以SDS和吐溫－80作表面活性劑；其他因素不變做單因子實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)研究確定最佳的碳源、氮源、無機(jī)鹽表面活性劑及添加量.

1.5 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)

通過前期的單因素試驗(yàn)研究，確定匍枝根霉的影響因素為：X1，麥麩玉米芯粉混合添加量（4，6）；X2，（NH4）2SO4（0.4，0.6）；X3，KH2PO4（0.2，0.3）；X4，MgSO4·7H2O（0.2，0.3）；X6，CaCl2（0.4，0.6）；X8，吐溫 －80（0.07，0.105）；X10，微量元素液（1，1.5）；X5，X7，X9，X11，空項(xiàng)（－1，1），設(shè)計(jì)PB實(shí)驗(yàn)，以木聚糖酶酶活為響應(yīng)值，用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（括號(hào)內(nèi)數(shù)字為PB實(shí)驗(yàn)低水平和高水平）.

1.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

通過PB實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O2，0.4%無水CaCl，1%的微量元素液，100mL的裝液量，10%的接種量，選定麥麩玉米芯粉混合添加量、（NH4）2SO4、吐溫－80 3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn).

1.7 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)

由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可知，根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)2的條件為中心點(diǎn)，利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素及水平表如表1所示.

表1 Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法回歸方程預(yù)測(cè)是否可靠，采用響應(yīng)面最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即：3.9%麥麩玉米芯，0.35%（NH4）2SO4，0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O，0.4%CaCl2，0.06%吐溫－80，1%的微量元素液，裝液量為100mL，pH自然，接種量為10%，在30℃，180r/min的搖床下培養(yǎng).通過5次平行試驗(yàn)來確定培養(yǎng)基的可信度.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定及單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 木糖在520nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線

木糖在520nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.通過碳源對(duì)酶活影響分析，當(dāng)以麥麩：玉米芯粉混合碳源為4%時(shí)，其產(chǎn)酶達(dá)到59.032U/mL；通過碳源的研究，確定（NH4）2SO4為最佳氮源，添加量為0.4%，產(chǎn)酶最高達(dá)55.322U/mL；通過無機(jī)鹽的研究，當(dāng)KH2PO4，MgSO4，CaCl2的添加量為0.2%時(shí)，其產(chǎn)酶達(dá)到61.970U/mL；通過表面活性劑對(duì)酶活影響的研究，添加吐溫－80為0.07%時(shí)，其產(chǎn)酶達(dá)到68.974U/mL.

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)1.6實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過軟件設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)，Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示，其方差分析如表3所示，得到木聚糖酶酶活為響應(yīng)值的線性回歸方程：Y＝63.86－8.63＊X1－4.81＊X2＋0.51＊X3－1.06＊X4－2.53＊X6－3.15＊X8－2.33＊X10.從各變量的系數(shù)可以看出，麥麩玉米芯粉混合添加量（X1），（NH4）2SO4（X2），MgSO4·7H2O（X4），無水 CaCl2（X6），吐溫 －80（X8），微量元素液（X10），呈負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)取低水平；KH2PO4（X3）呈正效應(yīng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)增加其含量.方差分析模型的Prob（P）＞F值為0.002 4，該模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.982 2，修正決定系數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；表明所得回歸方程達(dá)到極顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合很好.通過顯著性研究，X1，X2，X8對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量影響較大，通過爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化研究.

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 影響因素的顯著性分析

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4如示.由表4可知，木聚糖酶的產(chǎn)量隨著關(guān)鍵因素變化而變化，產(chǎn)量最高值出現(xiàn)在第2組，達(dá)到89.288U/mL，說明此時(shí)麥麩玉米芯粉的混合碳源、（NH4）2SO4、吐溫－80的濃度最高值接近最優(yōu)，故選擇第2組作為中心點(diǎn)，進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化.

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示.以木聚糖酶酶活為響應(yīng)值，對(duì)表5中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到的回歸方程：Y＝108.92＋3.9＊X1－1.6＊X2－2.24＊X3＋0.92＊X1X2－3.89＊X1X3＋回歸方程的方差分析如表6所示.該模型極顯著，即Pr＞F值＜0.0001.在該模型各參數(shù)中，X1對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量有較顯著的影響，即麥麩玉米芯粉混合碳源是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的因子對(duì)木聚糖酶的產(chǎn)量影響也達(dá)到顯著水平，說明（NH4）2SO4，吐溫－80對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響也是二次關(guān)系.該模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.9802，修正決定系數(shù)表明該模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值擬合良好，可以很好地解釋響應(yīng)值的變化.

表6 Box－Behnken回歸方程的方差分析

用Design expert 8.0.5軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖（見圖2）.由圖2及軟件分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn).通過分析可知，X1，X2，X3的編碼值分別為3.9%，0.35%，0.06%，即麥麩玉米芯粉混合碳源，（NH4）2SO4，吐溫－80的含量，此條件下預(yù)測(cè)得到木聚糖酶酶活為102.221U/mL.

圖2 響應(yīng)面法三維曲面和等高線圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最優(yōu)條件下，通過5次平行試驗(yàn)，所得木聚糖酶平均酶活為101.697U/mL，方差分析如表7所示.與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差在1%以內(nèi)，這表明響應(yīng)面法擬合的方程可以用于預(yù)測(cè)實(shí)際的木聚糖酶產(chǎn)量.

表7 平行試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)果與討論

木聚糖酶在飼料、食品、紡織等諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用，玉米芯粉和麥麩是農(nóng)業(yè)的副產(chǎn)物，具有較秸稈類半纖維素相對(duì)豐富，成本低來源廣的特點(diǎn)，是一種生產(chǎn)畜牧飼料添加劑的重要發(fā)酵碳源.吐溫－80具有低毒性的特點(diǎn)，適量的添加有助于酶的分泌.本研究篩選的匍枝根霉具有較高的木聚糖酶酶活，利用響應(yīng)面法進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，回歸方程精確度高，使培養(yǎng)基優(yōu)化更加合理性和科學(xué)性.

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化匍枝根霉產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基，提高該菌株的產(chǎn)酶量.在單因素水平試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)及響應(yīng)面分析，對(duì)各因素進(jìn)一步優(yōu)化，最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：3.9%麥麩玉米芯粉混合碳源，0.35%（NH4）2SO4，0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O，0.4%CaCl2，0.06%吐溫－80，1%的微量元素液，pH自然，液體培養(yǎng).在30℃，180r/min的搖床下培養(yǎng).木聚糖酶酶活可達(dá)到101.696 3U/mL，其產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了3.5倍，得到了較高的木聚糖酶酶活，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的匍枝根霉產(chǎn)木聚糖酶酶活.

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