香榧古樹的遺傳差異性

何 明，董雷鳴，劉浩凱，張 輝，曾燕如，錢秋鳳，喻衛(wèi)武，戴文圣

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

香榧古樹的遺傳差異性

何 明，董雷鳴，劉浩凱，張 輝，曾燕如*，錢秋鳳，喻衛(wèi)武，戴文圣

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

對香榧主產(chǎn)地浙江省諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安的5個香榧古樹群體共149個樣品進(jìn)行了SRAP標(biāo)記分析，共檢測到260個位點，其中多態(tài)位點170個，多態(tài)位點占為65.38%（PPL%）；群體觀察到的等位基因數(shù)（Na）為1.653 8，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.2713，基因多樣性指數(shù)（H）為0.169 6，Shannon信息指數(shù)（I）為0.266 4；群體總的基因多樣性指數(shù)（Ht）平均為0.1694，分化系數(shù)（Gst）為0.144 2，群體內(nèi)基因多樣度（Hs）為0.145 0，群體間基因流（Nm）為2.967 5；利用加權(quán)平均數(shù)法（UPGMA）對香榧古樹居群間進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果東陽、嵊州兩個居群先聚在一起，再與磐安居群聚在一起，而紹興和諸暨居群聚在一起，最后再與磐安、東陽、嵊州居群聚在一起。研究結(jié)果表明，香榧古樹接穗來源非唯一，是一個栽培類型，同時群體間有基因交流，既有分離又保持相對較高的相似性。

香榧；SRAP；遺傳差異

榧樹（Torreya grandis）隸屬紅豆杉科榧屬，為我國特有的古老物種之一，系第三紀(jì)孑遺植物[1]。香榧（T.grandis cv.Merrillii）是榧樹的優(yōu)良變異類型經(jīng)過人工選育后嫁接繁殖栽培的優(yōu)良栽培類型[2]，也是目前榧樹中唯一進(jìn)行人工規(guī)?；耘嗟膬?yōu)良栽培類型，起源于浙江省的會稽山區(qū)，具有千年的栽培歷史，以其特有的形態(tài)特征、生物學(xué)特性、經(jīng)濟(jì)性狀和產(chǎn)地分布而區(qū)別于其他榧樹自然類型，具有食用、藥用、材用、綠化等多種用途[3]。近年來香榧的經(jīng)濟(jì)效益不斷增長，因而在其生態(tài)適應(yīng)區(qū)得到了大力推廣與發(fā)展，在榧樹自然分布區(qū)安徽、江西等省大量引種栽培。其種仁炒熟后松脆可口，營養(yǎng)豐富，香味獨(dú)特，有化痰、止咳、潤肺、明目等功效。此外，香榧還可以提煉出具有抗癌活性的生理活性物質(zhì)——紫杉醇[4]。

國外由于沒有香榧種植栽培歷史，對香榧的研究報道極少。20世紀(jì)90年代開始，黎章矩等對香榧栽培類型中的性狀分離和再選擇進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，從香榧中選出了70多個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的優(yōu)株。從其研究結(jié)果看，香榧內(nèi)分離已很明顯。韓寧林等也有類似的發(fā)現(xiàn)[5]。近年來，香榧栽培類型內(nèi)退化和分離已普遍顯現(xiàn)，有的成年樹單株產(chǎn)量從幾千克到幾百千克不等，各地都有相當(dāng)比例的成年樹產(chǎn)量很低，甚至十多年、幾十年不結(jié)實。分析其原因，可能：①香榧嫁接起源母株不具備唯一性；②多次嫁接繁殖及其他的人為生產(chǎn)干預(yù)引起了分離及退化。因此，有必要開展香榧古樹的分子評價，探討主產(chǎn)區(qū)香榧的來源與分離程度，為今后保持香榧優(yōu)良遺傳本質(zhì)措施的制訂提供理論依據(jù)。

香榧的主產(chǎn)地在浙江會稽山區(qū)的5個縣（市），即諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安，中心產(chǎn)區(qū)不乏千年古樹。這五個縣市現(xiàn)有結(jié)實香榧大樹約10萬株左右，其中諸暨市約4萬余株，嵊州市2.83萬株，紹興縣1.7萬株，東陽市1.0萬株，磐安縣3 900余株；100年生以上大樹占80%以上，其中300 ～ 1 300 a的古樹超萬株，它們多以單株或小片古樹群的形式存在[6]，是浙江省現(xiàn)存的古樹名木群體中數(shù)量最多的樹種。

本研究利用SRAP標(biāo)記分析技術(shù)，以香榧主產(chǎn)地浙江會稽山區(qū)的5個縣（市）——諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安的香榧古樹（100年以上）樣本為實驗材料，評價古樹群體的遺傳差異性。相關(guān)的內(nèi)容尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自香榧主產(chǎn)地浙江會稽山區(qū)諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安5個縣（市）的香榧古樹林。采樣時由當(dāng)?shù)乩限r(nóng)做向?qū)?，確保采樣株的年齡在100 a以上。由于香榧是榧樹的優(yōu)良變異類型經(jīng)過人工選育后嫁接繁殖栽培的優(yōu)良栽培類型，因此每個群體單株間至少相距100 m。采摘的葉片存放在帶硅膠的塑料袋中，帶回實驗室后－40℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 DNA提取與檢測采用劉浩凱等優(yōu)化的改良CTAB法[7]。

1.2.2 SRAP標(biāo)記分析與產(chǎn)物檢測 劉浩凱等參照沈登峰的方法[8]，對包括PCR反應(yīng)體系、引物篩選及電泳在內(nèi)的SRAP分析體系進(jìn)行了優(yōu)化。本文采用的是優(yōu)化后的方法體系[7]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 電泳圖譜每一條帶（DNA片段）為一對引物的結(jié)合位點。對于多態(tài)位點，有擴(kuò)增產(chǎn)物的記作1，反之記為0，獲得二元數(shù)據(jù)矩陣，并計算多態(tài)位點百分率（PPL，%）。用Popgene 1.32分析觀察到的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、基因多樣性指數(shù)（Ht）、居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、居群間基因分化系數(shù)（Gst），并基于Gst計算居群間的基因流Nm =繪制基于親緣關(guān)系的居群聚類圖，評價群體內(nèi)及群體間的遺傳差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集

從浙江省磐安（PA）、東陽（DY）、嵊州（SZ）、紹興（SX）、諸暨（ZJ）分別采集了32、25、30、30、32個單株，共149個樣品。

2.2 DNA 的提取

采用改良CTAB法提取的香榧基因組DNA濃度較高，平均大于1 000 ng/μL，有的甚至高達(dá)3 000 ng/μL，且純度較高，OD260/OD280值1.8 ～ 2.0（表1）。電泳檢測表明，提取的DNA條帶清晰，質(zhì)量高（圖1），可以用于后續(xù)的實驗。

表1 部分樣品的DNA濃度及OD值Table 1 Concentration of gDNAs extracted from some of samples and their OD values

圖1 香榧基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測Figure 1 Electrophoresis profile of gDNAs extracted from T.grandis cv.Merrillii

2.3 SRAP 標(biāo)記分析

用篩選出的10對SRAP引物組合（表2）對149份香榧樣品進(jìn)行DNA擴(kuò)增，共檢測到260個清晰且可重復(fù)的有效位點，其中多態(tài)性位點170個，多態(tài)位點百分率為65.38%（圖2，表2）。各對引物擴(kuò)增的位點數(shù)為4～31個，擴(kuò)增片段大小為100 ～ 1 000 bp，每對引物擴(kuò)增出的多態(tài)位點百分率因引物而異，為22.22% ～ 96.88%。

圖2 部分樣品的SRAP擴(kuò)增譜帶（引物對F1R1）Figure 2 SRAP amplification band of the DNAs of some samples (primer pair: F1R1)

表2 SRAP引物組合及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 SRAP primer pairs and their amplification results

2.4 香榧古樹群體的遺傳差異性分析

在居群水平上，所有引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性在不同居群中的分布數(shù)量不同，不同居群的多態(tài)位點百分率為43.85% ～ 56.54%，由高到低依次是東陽、嵊州、諸暨、磐安、紹興居群；基于Shannon信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)、觀測的等位基因數(shù)及有效等位基因數(shù)的居群排列順序也相同，結(jié)果5個居群中東陽居群的遺傳差異性最大，紹興居群則最小。

5個香榧居群的Ht平均為0.169 4，Hs平均 0.145，Gst平均為 0.144 2，Nm平均為2.967 5，表明香榧居群內(nèi)遺傳差異性高于居群間，不同居群間遺傳分化相對較低。

表3 香榧5個居群的遺傳參數(shù)值Table 3 Genetic parameters in T.grandis cv.Merrillii from 5 counties

2.5 香榧古樹居群間的關(guān)系

5個古樹居群（PA、DY、SZ、SX、ZJ）的遺傳相似度在0.954 3 ～ 0.981 2，平均為0.964 5，平均遺傳距離為0.036 2，說明相似度較高；DY和SX之間的遺傳距離最小，為0.018 9；SZ與SX間的遺傳距離最大，為0.046 8（表4）。

表4 香榧古樹5個群體的遺傳相似性（對角線上）和遺傳距離（對角線下）Table 4 Nei’s genetic identity and genetic distance of T.grandis cv.Merrillii among 5 counties

基于 Nei's遺傳距離對各居群進(jìn)行UPGMA聚類可知（圖 3），東陽居群和嵊州居群聚在一起，再與磐安居群聚在一起；紹興居群和諸暨居群聚在一起，最后再與東陽、嵊州、磐安居群聚在一起。

圖3 香榧古樹5個居群基于Nei’s遺傳相似性的UPGMA聚類圖Figure 3 UPGMA dendrograme based on Nei’s genetic identity of T.grandis cv.Merrillii From 5 counties

3 討論

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對 5個香榧古樹群體的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，香榧物種水平的多態(tài)位點百分率PPL達(dá)65.38%，群體水平的PPL變幅較大，在22.22% ～ 96.88%，且東陽 ＞ 嵊州 ＞ 諸暨 ＞ 磐安 ＞ 紹興。與其他裸子植物基于ISSR或RAPD的PPL進(jìn)行比較，香榧比銀杏（PPB = 52.27%）、水杉（PPB = 38.62%）和銀杉（PPB = 32%）天然群體[9～11]要高得多。這說明香榧其接穗來源非唯一，是一個栽培類型；同時，經(jīng)過上千年的無性繁育，加上榧樹這個物種本身雌雄異株，香榧的授粉樹為榧樹的特性，在香榧這個栽培類型內(nèi)產(chǎn)生了遺傳分化。因此，香榧本身具有進(jìn)行再選擇的潛力及必要，同時也具有開展優(yōu)良雄性種質(zhì)資源選育的必要。

5個香榧古樹群體的Ht為 0.169 4，說明個體間存在基因變異。其中有 14.42%的遺傳差異存在于群體間，85.58%的遺傳差異存在于群體之內(nèi)，Gst為0.144 2，低于遠(yuǎn)交物種和多年生物種的平均值（Gst = 0.22和Gst = 0.19）[12]，表明香榧遺傳差異主要集中在群體內(nèi)。與雌性榧樹相比[7]，香榧Gst要高于榧樹，其余參數(shù)Ne、H、I、Ht、Hs、PPL、Nm等均低于榧樹；群體間遺傳相似度在0.95以上，說明香榧群體間既有基因交流，又保持相對較高的一致性。相對而言，5個居群中東陽居群的遺傳差異性最大，紹興居群的遺傳差異性最小，這一現(xiàn)象是否與香榧的起源有關(guān)還有待于進(jìn)一步探討。

基因流是影響群體內(nèi)部和群體間遺傳差異程度的重要因素[13]。遺傳結(jié)構(gòu)是通過物種群體內(nèi)和群體間遺傳分化來體現(xiàn)的，基因流的大小也可以反映群體遺傳結(jié)構(gòu)的大小。一般來說，基因流大的物種，種群間遺傳分化小，大的基因流可以阻止群體間的遺傳分化[14]。Hamrick等[15]認(rèn)為，基因流Nm大于1，就足以抵制遺傳漂變的作用，也同時防止了群體分化的發(fā)生。本研究中香榧古樹群體物種水平上的基因流（Nm）為2.967 5，表明群體之間存在著比較頻繁的基因交流，有效地阻止了遺傳漂變的發(fā)生，群體之間的遺傳差異不明顯。香榧為雌雄異株風(fēng)媒植物，且栽培較為集中，各群體間的地理位置較近，有利于群體間的基因交流。現(xiàn)實生產(chǎn)中，香榧與榧樹間自由雜交，只要是采自香榧的種子多是可食的，而大多數(shù)榧樹的種子食用質(zhì)量差，多用于實生繁殖，用作嫁接香榧的砧木。這也說明香榧是一個栽培類型。研究發(fā)現(xiàn)，從香榧與榧樹種子的品嘗評價看，種粒小，種形細(xì)長，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的榧樹種子風(fēng)味品質(zhì)好，反之一般不能直接食用[6]。盡管香榧種子自由授粉產(chǎn)生，結(jié)果在香榧栽培類型內(nèi)產(chǎn)生變異，但似乎香榧本身有一種選擇雄性花粉的機(jī)制，使得香榧種子具有含油率高、可食的特質(zhì)。

香榧的存在已有千年的歷史，其古樹群體應(yīng)該得到保護(hù)。但其在長期栽培過程中的退化、分離在所難免。為了保持香榧的品質(zhì)，有必要對其進(jìn)行再選擇復(fù)壯。

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Genetic Differences in Ancient Torreya grandis cv.Merrillii Trees

HE Ming，DONG Lei-ming，LIU Hao-kai，ZHANG Hui，ZENG Yan-ru*，QIAN Qiu-feng，YV Wei-wu，DAI Wen-sheng
（Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Leaves from 149 ancient Torreya grandis cv.Merrillii trees were collected in 5 counties (cities) such as Dongyang (DY), Pan’an (PA), Shengzhou (SZ), Zhuji (ZJ) and Shaoxing (SX), Zhejiang province.SRAP (sequence related amplified polymorphism) analysis on 149 samples resulted that a total of 260 loci was detected, among them 170 of polymorphic (Np), accounting for 65.38% of the total one.Number of alleles (Na) was 1.653 8, number of effective alleles (Ne) 1.271 3, Nei’s gene diversity index (H) 0.1696, Shannon Information index (I) 0.266 4, total gene diversity (Ht) 0.1694, genetic differentiation (Gst) 0.144 2, gene diversity within population (Hs) 0.145 0 and gene flow (Nm) 2.967 5.Cluster analysis indicated that the scions of the old trees may not be from the same source and there were gene exchanges among populations, which led to separation but relatively high identity.

Torreya grandis cv.Merrillii; SRAP; genetic difference

S718.46

A

1001-3776（2014）06-0001-05

2014-06-09；

2014-10-10

浙江省教育廳科研項目（Y201121027）；省科技廳浙江省果品農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12904-12）

何明（1979－），女，山東肥城人，助理研究員，碩士，從事森林培育研究；*通訊作者。