地骨皮醇提液對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響

洪秀芳施云福葉 真段淑芳

1浙江醫(yī)院 杭州 310013 2浙江省立同德醫(yī)院

3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 4浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

地骨皮醇提液對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響

洪秀芳1施云福2葉 真3段淑芳4

1浙江醫(yī)院 杭州 310013 2浙江省立同德醫(yī)院

3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 4浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

目的觀察地骨皮醇提液對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞（HBZY-1）單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）表達(dá)的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、單獨(dú)LPS作用組、藥物預(yù)處理（低、中、高濃度）＋LPS作用組。ELISA法測定細(xì)胞上清MCP-1含量，RT-PCR法檢測細(xì)胞因子MCP-1mRNA表達(dá)。結(jié)果LPS能夠顯著提高HBZY-1細(xì)胞MCP-1釋放量（P＜0.01），地骨皮醇提液預(yù)處理后，MCP-1含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。LPS能明顯激活MCP-1mRNA表達(dá)（P＜0.01），地骨皮醇提液預(yù)處理過后，能明顯降低MCP-1mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論地骨皮醇提液能夠抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞（HBZY-1）MCP-1mRNA的表達(dá)。

大鼠；腎臟；系膜細(xì)胞；MCP-1；地骨皮；LPS

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）常見病因之一[1-3]。目前臨床治療CRF的主要手段有血液透析和腎移植，但兩者均會(huì)給患者及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，如何延緩或阻止糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，有著重大的醫(yī)學(xué)意義。地骨皮具有涼血除蒸、清肺降火、生津止渴作用，被廣泛用于消渴癥（糖尿?。┑闹委焄4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察地骨皮醇提液對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響，探討地骨皮醇提液對(duì)糖尿病腎病的防治作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 細(xì)胞株HBZY-1（大鼠腎臟系膜細(xì)胞）購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司，常規(guī)傳代保存。地骨皮提取液由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提取。脂多糖：美國Sigma公司產(chǎn)品。DMEM高糖（25mmol/L）培養(yǎng)液美國GIBCO公司產(chǎn)品。新生牛血清（超級(jí)）：杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。胰酶、EDTA：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑鹽（MTT）：粉劑，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。RTPCR試劑盒：PrimeScriptTM RT-PCR Kit：Invitrogen公司產(chǎn)品。MCP-1引物、β-Actin：Invitrogen公司產(chǎn)品。ELISA試劑盒：美國ADL公司產(chǎn)品。Tag酶：TAKARA寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 常規(guī)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，按每個(gè)培養(yǎng)皿3×106將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、單純LPS作用組、不同濃度藥物處理+LPS作用組。①正常對(duì)照組：換用含2%胎牛血清的新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基（25mmol/L）。②單純LPS作用組：換用含2%胎牛血清的新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基后按10μg/mL加入LPS。③地骨皮醇提液處理＋LPS作用組：換用含2%胎牛血清新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基后，分組如下：地骨皮醇提液0.2mg/mL處理＋LPS作用組；地骨皮醇提液0.4mg/mL處理＋LPS作用組；地骨皮醇提液0.8mg/mL處理+LPS作用組。選取處于對(duì)數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，先用不同濃度（0.2mg/mL、0.4mg/mL和0.8mg/mL）地骨皮醇提液預(yù)處理細(xì)胞4h，然后按照LPS 10μg/mL處理HBZY-1細(xì)胞，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，1000rpm×5min離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞分別設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.2.2指標(biāo)檢測 ①M(fèi)CP-1測定：將已經(jīng)實(shí)驗(yàn)分組并予以藥物干預(yù)24h的細(xì)胞取其上清，通過ELISA法檢測細(xì)胞上清中MCP-1表達(dá)量。②MCP-1 mRNA測定：HBZY-1細(xì)胞生長至80%～90%融合后，換用2%新生牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基（25mmol/L）同步培養(yǎng)6h后，除正常對(duì)照組和單純LPS作用組外，其余三組加入不同濃度的地骨皮醇提液預(yù)孵育4h，除正常對(duì)照組外，其余各組按照10μg/mL加入LPS，作用24h，RT-PCR半定量法測定細(xì)胞內(nèi)MCP-1mRNA表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1地骨皮醇提液對(duì)MCP-1的影響 正常組HBZY-1細(xì)胞也會(huì)分泌MCP-1，但在LPS誘導(dǎo)下HBZY-1細(xì)胞MCP-1分泌量明顯增加（P＜0.01），經(jīng)過地骨皮醇提液作用后能顯著抑制細(xì)胞MCP-1分泌量（P＜0.05，P＜0.01），其中以0.4mg/mL地骨皮醇提液組作用最為顯著（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組HBZY-1細(xì)胞分泌MCP-1比較

2.2地骨皮醇提液對(duì)MCP-1 mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS誘導(dǎo)下的HBZY-1細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；地骨皮醇提液作用后能顯著抑制細(xì)胞MCP-1mRNA的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），其中以0.4mg/mL地骨皮組醇提液的抑制作用最為明顯（P＜0.01），見表1。

表1 各組HBZY-1細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)比較（）

表1 各組HBZY-1細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LPS作用組比較，▼P＜0.05，▼▼P＜0.01

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3 討論

MCP-1屬于趨化因子家族，是一些分子量相對(duì)較低的蛋白質(zhì)。MCP-1可由體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞等，具有趨化并激活單核細(xì)胞的功能。正常腎組織多種細(xì)胞（如系膜細(xì)胞）均能分泌MCP-1，微量MCP-1趨化少量的巨噬細(xì)胞吞噬有害物質(zhì)，從而發(fā)揮正常免疫防御作用[6]。當(dāng)腎組織受到刺激后，其MCP-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯增高，趨化并激活大量單核巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以通過釋放蛋白水解酶和氧活性物質(zhì)導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)損傷，并可釋放改變腎小球功能的細(xì)胞因子而致腎小球結(jié)構(gòu)重塑[7]。MCP-1還能劑量依賴性地增加白介素-6（interleukin-6，IL-6）和細(xì)胞間黏附分子（intercelluar adhesion molecule，ICAM）在腎小管上皮細(xì)胞（tubular epithelial cell，TECs）的表達(dá)和分泌，ICAM和IL-6可進(jìn)一步促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在腎組織浸潤[8]。MCP-1還以自分泌或旁分泌的方式直接刺激腎小球系膜細(xì)胞上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)[9]，加速糖尿病腎病腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。

地骨皮為茄科落葉灌木植物枸杞Lycium chinensis Mill或?qū)幭蔫坭絃ycium barbarum L的干燥根皮，味甘，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有涼血止血、清熱退蒸、清泄肺熱、清熱滋陰、清熱解毒的功效，符合2型糖尿病“清熱潤燥，養(yǎng)陰生津”的治療大法。臨床上常用其單味或復(fù)方治療糖尿病及其并發(fā)癥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[10]地骨皮能夠降低四氧嘧啶所致糖尿病大鼠的血糖，促進(jìn)肝糖原合成，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素。研究證明[11-12]地骨皮除降糖作用外，還有降血壓、降血脂、清除氧自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、拮抗炎癥反應(yīng)等作用。本實(shí)驗(yàn)前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)[13-14]地骨皮提取液可以降低2型糖尿病肥胖大鼠的體質(zhì)量，能夠改善其糖脂代謝紊亂、保護(hù)大鼠肝臟、腎臟，增加胰島素敏感性。降低血清炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的水平[15]，抑制胰島素抵抗的低度炎癥反應(yīng)以改善胰島素抵抗。并發(fā)癥的研究方面，發(fā)現(xiàn)地骨皮提取液可以抑制核因子受體-кB（nuclear factor，NF-кB）的表達(dá)[16]，降低血清炎癥因子水平，減輕過度的炎癥反應(yīng)，明顯改善腎臟病理和腎功能。

本研究顯示，地骨皮醇提液能抑制高糖環(huán)境下LPS致炎后大鼠腎臟系膜細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，這可能是地骨皮防治糖尿病腎病的分子機(jī)制之一，但有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Cortex Lycii on the Expression of Monocyte Chemotactic Protein 1 in Murine Renal Mesangial Cells Induced by Lipopolysaccharide

HONG Xiufang1,SHI Yunfu2,YE Zhen3,DUAN Shu-fang4. 1 Zhejiang Hospital, Hangzhou(310013),China;2 Tongde Hospital of Zhejiang Province;3 First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University;4 Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effect of ethanol extract of Cortex Lycii on monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）expression in lipopolysaccharide（LPS）-induced murine renal mesangial cells（HBZY-1）.MethodsHBZY-1 cells were conventionally cultured and divided into three groups:normal cell group,LPS-treated alone group,and Cortex Lycii+LPS-treated group.In a high-glucose condition,HBZY-1 cells were preincubated with different concentrations（0.2,0.4,and 0.8 mg/mL）of Cortex Lycii for 4h and then LPS of 10 μg/mL was added into 3 Cortex Lycii groups and LPS-treated alone group for another 24h.The release amount of MCP-1 in supernatant was detected by ELISA.The expression of MCP-1 mRNA was determined by RT-PCR.ResultsLPS markedly increased the release amount of MCP-1 in supernatant of HBZY-1 cells,but after treated with Cortex Lycii,the amount of MCP-1 decreased（P＜0.01）.LPS evidently activated the expression of the MCP-1 mRNA in HBZY-1 cells（P＜0.01）,but the pretreatment with Cortex Lycii decreased the expressions of MCP-1 mRNA（P＜0.05,P＜0.01）.ConclusionCortex Lycii can inhibit the expression of MCP-1 mRNA in HBZY-1 cells induced by LPS.

rats；kidney；mesangial cells；MCP-1；Cortex Lycii；LPS

2013-08-15