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    芍藥甘草湯對(duì)哮喘大鼠STAT 6與IL-13水平的影響

    2014-07-02 01:45:44雷蔡宛如朱詩乒
    關(guān)鍵詞:芍藥酸性甘草

    董 雷蔡宛如朱詩乒

    1浙江省新華醫(yī)院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫(yī)院呼吸科

    ·論 著·

    芍藥甘草湯對(duì)哮喘大鼠STAT 6與IL-13水平的影響

    董 雷1蔡宛如1朱詩乒2

    1浙江省新華醫(yī)院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫(yī)院呼吸科

    目的觀察芍藥甘草湯對(duì)哮喘大鼠信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT 6)與白介素-13(IL-13)水平的干預(yù)作用,探討其防治支氣管哮喘的作用機(jī)制。方法60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NULL組)、模型組(OVA組)、地塞米松組(DXM組)及芍藥甘草湯高(SG10組)、中(SG5組)、低(SG2.5組)劑量組,每組10只。除正常對(duì)照組外均行支氣管哮喘造模,相應(yīng)藥物灌胃。檢測(cè)各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù),免疫組化法測(cè)肺組織中STAT 6蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)血漿中IL-13含量。結(jié)果與NULL組比較,OVA組哮喘大鼠肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及氣道上皮STAT 6表達(dá)和血漿IL-13水平均明顯升高(P<0.01)。DXM組及各劑量芍藥甘草湯組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、氣道上皮STAT 6表達(dá)和血漿IL-13水平較OVA組降低(P<0.01),但仍高于NULL組(P<0.01)。結(jié)論芍藥甘草湯防治大鼠支氣管哮喘的作用機(jī)制可能與抑制哮喘大鼠肺組織STAT 6表達(dá),降低血漿IL-13水平,降低哮喘大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)。

    大鼠;哮喘;芍藥甘草湯;信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6;白介素-13

    支氣管哮喘是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病。芍藥甘草湯系張仲景《傷寒論》中的著名方劑,主要由芍藥和甘草二味中藥等量組成,藥理研究證實(shí),芍藥甘草湯具有明顯的解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[1]。近十幾年來,單用此方或隨癥加減治療哮喘、頑咳和小兒百日咳療效十分顯著[2]。本研究旨在探討芍藥甘草湯治療哮喘的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):2011A032。

    1.2試劑與藥物 卵白蛋白(Sigma公司);氫氧化鋁干粉(廣州化學(xué)試劑廠,批號(hào)961201-2);地塞米松片(浙江仙居制藥股份有限公司);IL-13 ELISA試劑盒(ADL公司,批號(hào)070633);免疫大鼠STAT6多克隆抗體(晶美公司);芍藥甘草湯(芍藥、甘草等分組成,藥材由浙江省中醫(yī)院中藥房提供,濃煎成每毫升含1g生藥);

    1.3實(shí)驗(yàn)儀器 M304020壓縮霧化機(jī)(德國(guó)百瑞公司),OLYMPUS BX50顯微攝像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

    1.4動(dòng)物分組及模型建立 60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NULL組)、模型組(OVA組)、地塞米松組(DXM組)、芍藥甘草湯高劑量組(SG10組)、芍藥甘草湯中劑量組(SG5組)、芍藥甘草湯低劑量組(SG2.5組),每組10只。除正常對(duì)照組之外,其余各組均進(jìn)行支氣管哮喘造模[3]。造模方法:第1、7、14天分別給予雞卵白蛋白(OVA)抗原液1mL(含OVA 10mg,氫氧化鋁凝膠20mg,滅活百日咳桿菌5×109個(gè))腹腔注射,1天1次,第21天開始給予1%OVA溶液霧化吸入,1天1次,每次30min,連續(xù)3天。以大鼠出現(xiàn)呼吸急促,點(diǎn)頭呼吸,甚則四肢末端紫紺為造模成功的標(biāo)志。正常對(duì)照組:第1、7、14天分別給予生理鹽水1mL腹腔注射,第21天開始給予生理鹽水超聲霧化吸入,1天1次,每次30min,連續(xù)3天。

    1.5給藥方法 每次霧化前30min,NULL組、OVA組予生理鹽水10mL/kg體質(zhì)量灌胃;DXM組予DXM 1mg/kg灌胃;SG10組、SG5組、SG2.5組予芍藥甘草湯10g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃。

    1.6標(biāo)本采集和處理 各組均于首次霧化后5d采集和處理標(biāo)本。每組大鼠均予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取血制備血漿,右肺肺泡灌洗,左肺留取病理。

    1.7檢測(cè)指標(biāo)及方法

    1.7.1支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定 取血完畢后大鼠行氣管插管至右肺并結(jié)扎,用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗,每次3mL,反復(fù)灌洗3次,回收率均大于50%,取0.1mLBALF在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算白細(xì)胞總數(shù),然后將BALF離心10min(1000rpm),離心沉淀后細(xì)胞團(tuán)重懸于1mLPBS(磷酸鹽緩沖溶液)中,取0.2mL圖片,瑞吉染液染色,至少計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞做細(xì)胞分類,再計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。

    1.7.2血漿IL-13測(cè)定 各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,剖腹,分離腹主動(dòng)脈取血,37℃水浴15min,3000r/min離心20min,取上部血清,保存于-20℃冰箱中。用ELISA法測(cè)定血清IL-13。

    1.7.3氣道上皮STAT 6蛋白檢測(cè) 肺組織切片后用免疫組化法進(jìn)行測(cè)定。光學(xué)顯微鏡下觀察5個(gè)完整的氣道橫切面免疫組化圖像,氣道上皮細(xì)胞STAT 6陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿和/或胞核黃色染色,對(duì)圖像進(jìn)行攝影,利用圖像分析儀對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算STAT 6蛋白的陽性表達(dá)單位(PU,positive unit)。

    1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組間比較采用單因素方差分析,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 OVA組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較NULL組明顯升高(P<0.01);DXM組和各劑量芍藥甘草湯組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較OVA組減少(P<0.01),但高于NULL組(P<0.01);SG2.5組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于DXM組和其他劑量SG組(P<0.05);DXM組與SG10、SG5組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.2各組血漿IL-13含量比較 OVA組血漿IL-13含量較NULL組升高(P<0.01);DXM組和各劑量芍藥甘草湯組血漿IL-13較OVA組減少(P<0.01);DXM組IL-13含量低于不同劑量SG組(P<0.05);SG10、SG5、SG2.5組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

    表1 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較() ×107/L

    表1 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較() ×107/L

    注:與NULL組比較,*P<0.01;與OVA組比較,▲P<0.01;與SG2.5組比較,△P<0.05

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    表2 各組大鼠血漿IL-13比較()pg/mL

    表2 各組大鼠血漿IL-13比較()pg/mL

    注:與NULL組比較,*P<0.01;與OVA組比較,▲P<0.01;與DXM組比較,☆P<0.05

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    2.3 各組大鼠氣道上皮STAT 6蛋白表達(dá) OVA組氣道上皮STAT 6陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯高于NULL組(P<0.01);DXM組和不同劑量SG組陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯低于OVA組(P<0.01);DXM組和SG10、SG5組STAT6的陽性細(xì)胞表達(dá)量低于SG2.5組(P<0.05);DXM組與SG10、SG5組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

    表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達(dá)()pg/mL

    表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達(dá)()pg/mL

    注:與NULL組比較,*P<0.01;與OVA組比較,▲P<0.01;與SG2.5組比較,△P<0.05

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    3 討論

    支氣管哮喘是一種氣道慢性變應(yīng)性炎癥性疾病,多種炎性細(xì)胞參與哮喘發(fā)病過程,目前認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞,大多數(shù)炎性細(xì)胞最終通過EOS產(chǎn)生效應(yīng)[4]。IL-13是一種主要由活化的Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子,可刺激細(xì)胞的增殖和合成,通過與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的作用而誘發(fā)哮喘的急性發(fā)作。近年研究表明,IL-13可不依賴于IL-4、IgE及嗜酸粒細(xì)胞等傳統(tǒng)途徑而誘發(fā)哮喘的所有癥狀,因此,IL-13被認(rèn)為是哮喘發(fā)病中極為重要的一種介質(zhì)[5]。STAT 6是一種能被眾多細(xì)胞外多肽類分子激活、參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子,它通過JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-4、IL-13等的生物學(xué)活性。Akimoto等[6]研究發(fā)現(xiàn),STAT 6基因缺陷小鼠(STAT 6-/-)吸入卵蛋白致敏后,肺泡灌洗液中未發(fā)現(xiàn)EOS浸潤(rùn),肺組織、支氣管黏膜、支氣管周圍組織未見炎癥反應(yīng),氣道反應(yīng)性試驗(yàn)未見氣道反應(yīng)性增高。研究表明,STAT 6通過調(diào)節(jié)Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖與分化、參與IgE的同種型轉(zhuǎn)換,在支氣管哮喘病理生理過程中起重要作用。

    研究表明,芍藥的主要成分芍藥總苷是一種雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)藥,而甘草的主要成分甘草次酸有明顯的皮質(zhì)激素樣作用。Takagi[7]實(shí)驗(yàn)表明,甘草次酸抑制炎癥反應(yīng)的效價(jià)為氫化可的松的1/10。熊谷朗報(bào)道,甘草次酸能抑制IgE和組胺的合成從而發(fā)揮抗炎、抗過敏作用,而且芍藥總苷和甘草次酸具有協(xié)同作用[8]。

    本研究表明,芍藥甘草湯可明顯抑制哮喘大鼠的氣道黏膜炎癥和EOS浸潤(rùn),同時(shí)降低IL-13水平和氣道上皮STAT6表達(dá),說明芍藥甘草湯治療哮喘的作用可能通過上述機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

    [1]曹艷,旺建偉,段淑香,等.芍藥甘草湯臨床及藥理研究近況[J].中醫(yī)藥信息,2006,23(3):41-43.

    [2]鄭繼生,錢景莉.芍藥甘草湯及其臨床運(yùn)用[J].河南中醫(yī),2012,32(8):966-968.

    [3]王洋,關(guān)煒,李韶妮.芍藥甘草湯防治支氣管哮喘機(jī)理研究[J].山西中醫(yī),2011,27(9):43-45.

    [4]Lampinen M,Hakansson L,Venge P.Interleukin-2 inhibit eosinophil migration but is counteracted by IL-5 priming[1].Clin Exp Allergy,2001,31(2):249-258.

    [5]Wills-Karp M,Luyimbazi J,Xu X,et al.Interleukin-13:central mediator of allergic asthma[J].Science,1998,282(3597):2258-2261.

    [6]Akimoto T,Numata F,Tamura M,et al.Abrogation of bronchia Eosinophilic inflammation and airway hyperreactivity in signal transducers and activators of transcription(STAT)b-deficient mice[J].J Exp Med,1998,187(9):1537-1542.

    [7]Takagi.Study of Glycyrrhiza uralensis[J].International journal of Oriental Medicine 1989,14(4):185.

    [8]中國(guó)醫(yī)科院藥物研究所等.中藥志[M].北京:人民衛(wèi)生出社,1993:183-184.

    Effects of Shaoyaogancaotang on STAT6 and Interleukin-13 in Asthmatic Rats

    Dong Lei1,CAI Wanru1,ZHU Shiping2. 1 Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310005),China;2 Department of Respiratory Diseases,Hangzhou Chinese Medical Hospital.

    ObjectiveTo observe the effect of Shaoyaogancaotang(SG)on signal transducer and activator of transcription 6(STAT6)and interleukin-13 in asthmatic rat,and to explore the possible mechanism of SG to asthma.MethodsSixty SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group(group NULL),asthmatic group(group OVA),dexamethasone group(group DXM),group SG10,group SG5,and group SG2.5.Before nebulization,group NULL and OVA was given saline of 10ml/kg intragastrically,group DXM was given DXM of 1 mg/kg,and groups SG were given SG of 10,5,and 2.5 g/kg,respectively.The numbers of total leukocytes and eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured by light microscope.The protein expression of STAT6 in airway epithelium was shown by immunohistochemistry.The serum IL-13 were detected by ELISA.ResultsAfter sensitized and challenged,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF of OVA-treated rats significantly in creased compared with group NULL(P<0.01).After treatment with different dosages of SG and dexamethasone,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF,the STAT6 protein expression,and serum IL-13 were significantly lower than those in group OVA(P<0.01),but higher than those in group NULL(P<0.01).ConclusionShaoyaogancaotang can significantly inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,decrease the IL-SG can inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,and decrease the serum IL-13 and the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF.SG might be of potential value in protection and treatment of asthma.

    asthma;Shaoyaogancaotang;signal transducer and activator of transcription 6;interleukin-13

    2013-09-20

    浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金計(jì)劃(No.2012ZQ013)

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