利用正交試驗優(yōu)化苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)

郭剛

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100

利用正交試驗優(yōu)化苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)

郭剛

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100

本研究采用正交試驗方法，以苦馬豆幼苗不同部位為外植體與較適愈傷組織誘導(dǎo)激素配比的篩選，探究不同外植體及激素組合對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦馬豆幼苗子葉為較適外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA1.0mg/L+2,4-D0.50mg/L激素配比為較適配方，為苦馬豆組培工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

苦馬豆；外植體；愈傷組織；正交試驗設(shè)計

苦馬豆[Swainsonasalsula（Pall.)DC]隸屬豆科苦馬豆屬植物，別名羊尿泡，屬多年生草本或小喬木[1]。以全草、根、果實入藥，具有利尿、消腫、降壓等功效，主要分布于中亞及我國西北地區(qū)，我國僅有一屬一種[2～4]。

苦馬豆的次生代謝產(chǎn)物—苦馬豆素,具有抗腫瘤、抗AIDS病毒和增強肌體免疫力的活性[5～6]，有可能成為一種很有前途的腫瘤治療輔助藥物,因而備受關(guān)注。西北農(nóng)林科大博士生導(dǎo)師曹光榮教授認(rèn)為苦馬豆素最大的優(yōu)勢在于，在殺死癌細(xì)胞的同時，對人體免疫系統(tǒng)具有保護(hù)作用，毒副作用極其微弱。同時，苦馬豆素用于抑制腫瘤將使珍稀瀕危藥材——紫杉醇有了來源廣泛的替代品[7]。

近年，過度放牧、過度農(nóng)墾和不合理采集地下水資源等原因?qū)е峦恋厣衬?，生態(tài)環(huán)境日益惡化，植被遭到破壞，而且采集和消耗苦馬豆的數(shù)量已經(jīng)超過野生苦馬豆資源的再生能力，野生苦馬豆資源數(shù)量急劇下降，日趨匱乏。目前，前人對其無性再生研究已有報道，但對愈傷組織誘導(dǎo)體系優(yōu)化篩選的文獻(xiàn)未見有詳細(xì)報道，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，研究意義：一是利用正交試驗設(shè)計方法進(jìn)一步探討不同外植體及激素配比對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選較有利于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體及培養(yǎng)基激素配比，以建立并優(yōu)化苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)體系；二是，已報道一些黃酮類成分已從該植物的全草中分離到，但從離體培養(yǎng)的愈傷組織中分離出有效藥用成分未見報道，故本試驗的結(jié)果對苦馬豆愈傷組織細(xì)胞的離體培養(yǎng)和其代謝產(chǎn)物的研究有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

苦馬豆種子（采集于新疆昌吉市二六工鎮(zhèn)），經(jīng)過浸泡處理，剝?nèi)シN皮，平鋪在墊濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在23℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，幼苗生長至5～6cm時，無菌處理，取上胚軸、下胚軸、子葉切段作為試驗材料。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用MS為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）正交設(shè)計，每個設(shè)計安排9次試驗。試驗因子及水平安排見表1，其中A為外植體，B為6-BA，C為2，4-D，D為光照。共9個處理，每處理接種10瓶，每瓶接種4塊外植體。接種后42d統(tǒng)計結(jié)果，并進(jìn)行極差分析。

表1 L9(34)因子水平

1.3 試驗方法

1.3.1 無菌材料的獲得

無菌苗培養(yǎng)，挑選飽滿成心形的種子用濃硫酸浸泡20min，用自來水清洗，在超凈工作臺中紫外光殺菌15min，升汞消毒15min，無菌水沖洗5～6遍，75%酒精浸泡20s，再用無菌水沖洗4～5遍，接種在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，5d后長出幼苗。

1.3.2 外植體接種

無菌條件下將子葉和胚軸剪成1～2cm小段，分別接種在9個處理中，每個處理設(shè)10次重復(fù)，每瓶接種4個外植體，以探索不同種類、不同濃度激素對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 外植體人工培養(yǎng)

將無菌接種的外植體分別培養(yǎng)于25±1℃，的光照培養(yǎng)室和人工暗培養(yǎng)箱中，光照強度1500～2 000lx，光照時間14h/d。

1.3.4 觀察與記錄

每隔10d觀察、記錄1次。其中：愈傷組織誘導(dǎo)率=長愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

苦馬豆接種15d觀察到外植體切口處開始扭曲、腫脹，有愈傷組織萌動的跡象；第18d腫脹明顯，表面呈疙瘩狀突起，并形成少量愈傷組織；第27d整個子葉愈傷化，并形成大量愈傷組織；第37d白綠色愈傷組織大量增殖，基本見不到原接種外植體。第37d調(diào)查的愈傷組織誘導(dǎo)率，L9 (34)正交試驗結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

根據(jù)表2得知，苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)各因素水平的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D2。，即最適外值體為上胚軸，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/ L+2,4-D0.50mg/L，最佳光照為白光：由極差R值可看出，在該試驗中B為主導(dǎo)因素，4個因子對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響程度依次為：6-BA＞2,4-D＞外植體＞光照。

3 結(jié)論與討論

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)與外植體的生理成熟度有關(guān)

外植體的選擇在理論上，任何具有生命力的植物的組織或器官都具有育成完整生物個體的潛在能力，都能作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，但研究表明，植物種類以及發(fā)育階段、年齡、生理狀態(tài)、外植體的大小、外植體在樹體和枝條上的位置、外植體的采集時間、季節(jié)等不同，其無性繁殖的能力也不一樣。同一種植物不同的組織和器官其再生能力也有很大差異[8]。

該試驗以苦馬豆無菌幼苗上胚軸、下胚軸、子葉為外植體，試驗結(jié)果表明，苦馬豆幼苗上胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，這與上胚軸自身含有部分天然生長激素有關(guān)?？梢?，愈傷組織的誘導(dǎo)與外植體的生理成熟度密切相關(guān)。

3.2 培養(yǎng)基激素配比

細(xì)胞分裂素和生長素的配比對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)起著非常重要的作用，在該試驗中，2個激素因子對苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)均產(chǎn)生影響，2，4-D對苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)起到明顯的促進(jìn)作用。在苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)中生長素與細(xì)胞分裂素最佳濃度配比為6-BA1.0mg/L+2，4-D0.50mg/L。

3.3 光照條件

同波長的光對器官脫分化和細(xì)胞分裂有影響，光質(zhì)通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶活性來調(diào)節(jié)糖分解的快慢，從而調(diào)節(jié)ATP、NADPH和其他合成代謝所需的小分子物質(zhì)的產(chǎn)生，以適應(yīng)生理需要[9]。該研究中，在白光光照條件下苦馬豆脫分化產(chǎn)生愈傷組織細(xì)胞較快且生長量較多，紅、藍(lán)光次之，暗培養(yǎng)對苦馬豆愈傷組織產(chǎn)生的作用最小。

本試驗中藥用植物苦馬豆高效組織培養(yǎng)技術(shù)的建立為后續(xù)各種科技研究工作提供了相應(yīng)平臺，如利用現(xiàn)代生物技術(shù)離體懸浮培養(yǎng)苦馬豆愈傷組織，研究其代謝抗腫瘤新藥苦馬豆素的路徑和生理調(diào)控。

[1]馬金雙.關(guān)于苦馬豆屬學(xué)名的討論[J].云南植物研究，1991，13（4）:380-382.

[2]王進(jìn),王桔紅,張勇,等.苦豆子和苦馬豆種子特性及硬實破除研究[J].中藥材，2011，34（5）:670-673.

[3]周吉林,伍春蓮,陳衛(wèi)英.光照及黑暗條件下不同濃度2，4-D對誘導(dǎo)苦馬豆愈傷組織的影響[J].內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報，2009，24（12）:41-44.

[4]崔小蓉,劉慧,楊軍.鈣鹽脅迫下苦馬豆愈傷組織生理指標(biāo)研究[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011，32（3）: 259-263.

[5]楊鳴琦.苦馬豆素對小白鼠移植性腫瘤S180，ARS的抑制試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1998，19（2）:26-29.

[6]吳達(dá)，梁冰，馮志剛，等.苦馬豆素研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003，22（2）:42～45.

[7]毛海峰.2003.當(dāng)代健康報[N].2003.7:17.

[8]薛春麗，郭俊明，李鐵梅.L9（34）正交試驗設(shè)計對白花蛇舌草愈傷組織誘導(dǎo)方案的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（21）：11122—11123.

[9]王亞麗，王曉東，趙兵，等.光質(zhì)對瑪咖愈傷組織生長、分化的影響[J].過程工程學(xué)報，2007，7（4）：782-785.

郭剛（1977年—），講師，碩士，研究方向為植物抗逆生理與藥用植物組培。

新疆自然科學(xué)基金項目（2011211A087）。

2014-02-27