蒲黃、松花粉等花粉類藥材及其混偽品的DNA條形碼鑒定

馬孝熙+孫偉+任偉超+向麗+趙博+張雅琴+宋明+慕澤涇+陳士林

[摘要]目前市場上花粉類藥材品種較多，由于在外觀形態(tài)均呈粉末狀，很難區(qū)分，加之市場價(jià)格較高等因素，故混用和摻偽的情況時(shí)有發(fā)生，因此花粉類藥材的準(zhǔn)確鑒定對公眾的用藥安全顯得尤為重要。該研究采用DNA條形碼技術(shù)，對蒲黃、松花粉及其混偽品的基原植物及藥材共60份樣本進(jìn)行研究。通過primer premier 6.0設(shè)計(jì)出蒲黃ITS2特異性引物PhF-R，其擴(kuò)增效率高達(dá)100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蒲黃藥材的ITS2序列長度為234～249 bp，種內(nèi)K2P平均距離與同屬種間K2P平均距離十分接近，但遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間K2P平均距離；松花粉藥材的ITS2序列長度均為247 bp，ITS2序列種內(nèi)平均K2P遺傳距離遠(yuǎn)小于其與混偽品種間平均K2P距離。利用ITS2序列構(gòu)建的鄰接（NJ）樹表明蒲黃、松花粉及其混偽品可明顯區(qū)分，并呈現(xiàn)出良好的單系性。因此，DNA條形碼可對該實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)確鑒定，有助于花粉類藥材的監(jiān)管及市場流通。

[關(guān)鍵詞]ITS2；蒲黃；松花粉；DNA條形碼

花粉為植物的雄性細(xì)胞，由于其中蘊(yùn)含著豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，所以具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值^[1]。蒲黃^[2]為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L.、東方香蒲T. orientalis Presl.或同屬植物的干燥花粉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、性平，具有涼血止血、活血化瘀的功效^[3-6]。松花粉^[7]，即松科植物馬尾松Pinus massoniana Lamb.、油松P. tabuliformis Carr.或同屬數(shù)種植物的干燥花粉，始載于《新修本草》，味甘平無毒^[8]，具有收斂止血、燥濕斂瘡的功效。

近年來國內(nèi)花粉市場異常火爆，其價(jià)格連年攀升。有文獻(xiàn)報(bào)道^[9-13]蒲黃、松花粉、海金沙Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.及市售的玉米花粉Zea mays L.存在摻偽的情況，因此對幾種易混花粉類藥材進(jìn)行有效鑒定顯得至關(guān)重要。陳樹山^[9]、賈荷麗^[10]、陳永林^[11]、任燕^[13]等曾從性狀、理化及顯微方面對花粉類藥材進(jìn)行鑒別，但傳統(tǒng)的鑒定方法在一定程度上由于藥材本身、實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等方面的差異而影響對藥材的準(zhǔn)確鑒定。

基于DNA測序和序列比對的DNA條形碼技術(shù)是近年來分子生藥鑒定的研究熱點(diǎn)和方向^[14]。DNA條形碼（DNA barcoding）是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)。該技術(shù)于2003年由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert首次提出，并受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。Paul提出以一段650 bp的線粒體基因COI作為動(dòng)物的通用條形碼^[15-16]。在植物方面，陳士林等對6 000余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA條形碼序列篩選，提出以ITS2為主，psbA-trnH為輔的藥用植物條形碼鑒定體系^[17-21]。該體系已在羌活^[22]、金銀花^[23]、冬蟲夏草^[24]、石斛^[25]等貴重藥材上得到了驗(yàn)證。因此本研究選用ITS2序列來鑒定易混淆花粉類藥材，為確保藥材質(zhì)量及臨床用藥安全提供參考。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)所研究的材料共60份，其中19份為基原植物樣本，采集于新疆、河北、河南、安徽、廣東、廣西、云南、北京等地，所有基原植物經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，材料來源見表1；其余41份為藥材樣本，購于北京、河北、安徽、重慶、黑龍江等地的藥市或藥店，詳細(xì)信息見表2。

2 方法

2.1 DNA的提取 對于葉片樣本，取樣品約25 mg，用球磨儀（Sceintz-48，寧波新芝）以50次/s研磨2 min，使用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA；而粉末狀藥材，取樣品約40 mg，加700 μL DNA裂解液，在56 ℃水浴的條件下過夜，采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。

2.2 蒲黃引物設(shè)計(jì) 利用MEGA5.0對ITS2通用引物擴(kuò)增出的序列進(jìn)行分析，定位至蒲黃的“保守區(qū)域”，并運(yùn)用primer premier 6.0設(shè)計(jì)特異性引物PhF-R。其序列如下，Ph-F：5′-CGCGAACCATCGAGTCTTT-3′，Ph-R：5′- GTTTCTTCTCCTCCGCTTATTT-3′。

2.3 PCR擴(kuò)增和測序 對于非香蒲屬樣本，選取ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′ 和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′作為擴(kuò)增引物。反應(yīng)條件為94 ℃變性5 min，經(jīng)過40個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物2.5 μmol·L-1各1.0 μL，DNA模板量約30～60 ng，其余用ddH2O補(bǔ)至25 μL；而香蒲屬樣本，選用PhF-R為ITS2擴(kuò)增引物，退火溫度54 ℃，其他條件同上。電泳檢查PCR擴(kuò)增情況，進(jìn)行雙向測序。

2.4 ITS2序列分析 對獲得的測序結(jié)果使用Codoncode Aligner V3.7.1校對拼接，刪除低質(zhì)量區(qū)，去除引物區(qū)?；陔[馬爾可夫模型HMMer注釋除去5.8S和28S，從而獲得ITS2序列。運(yùn)用軟件MEGA 5.0對所有ITS2序列進(jìn)行分析比對^[26]。基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算、系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建，對于系統(tǒng)樹各分支的置信度采用自舉檢驗(yàn)法bootstrap檢驗(yàn)（1 000次重復(fù)）。endprint

3 結(jié)果與分析

3.1 蒲黃PCR擴(kuò)增效率 本實(shí)驗(yàn)中，以蒲黃藥材及基原植物共29份樣本的總DNA為模板，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅有2份樣本的DNA擴(kuò)增成功，且測序正常，擴(kuò)增效率僅為6.70%。根據(jù)已獲得的2條蒲黃ITS2序列，對蒲黃重新設(shè)計(jì)引物。采用針對蒲黃已知序列設(shè)計(jì)的新引物，對之前提取的總DNA進(jìn)行重新擴(kuò)增，結(jié)果顯示29份樣本全部擴(kuò)增成功，其中26份樣品測序結(jié)果合格，擴(kuò)增效率高達(dá)100%。

3.2 市場上購買的藥材的鑒定 對市場上購買的41份藥材樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的ITS2序列進(jìn)行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)：22份蒲黃藥材中有7份樣品（KJ474686～92）與GenBank登陸號KF265389的相似度為100%，比對結(jié)果為長苞香蒲；有6份樣品（YC0518MT10～15）與GenBank登錄號KF265390的最高相似度為84%，比對結(jié)果為香蒲屬植物，暫不能鑒定到種；有6份樣品（KJ474656～61）與GenBank登陸號FJ949066，DQ996015的相似度為100%，比對結(jié)果為水稻；此外，22份蒲黃藥材中有3份樣品（YC0518MT16～18）在測序過程中存在套峰的情況。8份松花粉藥材中有5份樣品（KJ474648～52）與GenBank登錄號GQ434744的相似度為100%，比對結(jié)果為馬尾松；其余3份樣品與GenBank登錄號JF829712，JF829701，GQ434747的相似度均為100%，比對結(jié)果為松屬植物，暫不能鑒定到種。按照同樣的方法，4份海金沙藥材的鑒定結(jié)果均為海金沙。7份玉米花粉材料的鑒定結(jié)果均為玉米。

3.3 松花粉、蒲黃及混偽品的種內(nèi)、種間變異分析 馬尾松P. massoniana 種內(nèi)不同來源樣品8條ITS2序列長度為247 bp，平均GC含量為60.73%，種內(nèi)K2P距離為0，種內(nèi)無變異位點(diǎn)，共獲得KJ474648型1種單倍型。油松P. tabuliformis 種內(nèi)不同來源樣品3條ITS2序列長度為247 bp，GC含量為60.32%，種內(nèi)K2P距離為0，種內(nèi)無變異位點(diǎn)，共獲得KJ474642型1種單倍型。松花粉未定種的3份樣品（YC0405MT02～04）的ITS2序列長度為247 bp，共獲得YC0405MT02型1種單倍型。對3個(gè)物種的序列分析發(fā)現(xiàn)，僅在74 bp處有一變異位點(diǎn)，即馬尾松在74 bp處的堿基為C，油松和未定種樣品的序列在74 bp處為T。油松與馬尾松的種間距離為0.004，與混偽品的最小種間距離為0.657；馬尾松與混偽品的最小種間距離在0.670。

長苞香蒲T. domingensis 種內(nèi)不同來源樣品9條ITS2序列長度為234 bp，平均GC含量為78.63%，種內(nèi)K2P距離為0，種內(nèi)無變異位點(diǎn)，共獲得KJ474686型1種單倍型。水燭香蒲T. angustifolia 種內(nèi)不同來源樣品3條ITS2序列長度為234 bp，平均GC含量為79.92%，有2個(gè)位點(diǎn)存在變異，即81位點(diǎn)處A-G變異和141位點(diǎn)處T-C變異，共獲得3種單倍型。種內(nèi)最大K2P距離為0.022，與混偽品的最小種間距離為0.337。蒲黃未定種的6份樣品（YC0518MT10～15）的ITS2序列長度為249 bp，共獲得YC0518MT10型1種單倍型。序列比對信息見表3。

海金沙L. japonicum種內(nèi)不同來源樣品7條ITS2序列長度為267 bp，共獲得5種不同的單倍型，其中KJ474663型3條，KJ474662型1條，KJ474665型1條，KJ474666型1條，KJ474668型1條。玉米花粉Zea mays種內(nèi)不同來源樣品10條ITS2序列長度為224 bp，共獲得4種不同的單倍型，其中KJ474669型7條，KJ474671型1條，KJ474674型1條，KJ474678型1條。水稻Oryza sativa種內(nèi)不同來源樣品6條ITS2序列長度為232 bp，共獲得KJ474656型1種單倍型?；诘玫降腎TS2序列的單倍型，運(yùn)用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。從所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出松花粉、蒲黃、海金沙、玉米花粉、水稻各獨(dú)聚一支，因此，ITS2序列能準(zhǔn)確鑒別蒲黃、松花粉等花粉類藥材及其混偽品。

4 討論

蒲黃為多年水生草本單子葉植物，國外學(xué)者對水生單子葉植物的DNA條形碼有比較深入的研究^[27]。在本研究的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用通用引物（ITS2F-3R）擴(kuò)增蒲黃藥材時(shí)，擴(kuò)增效率僅為6.70%，這有可能是ITS2F-3R在單子葉植物中的通用性不高導(dǎo)致的。因此筆者以己獲得的2條蒲黃序列為研究對象，運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件重新設(shè)計(jì)了一對引物（PhF-R），其擴(kuò)增效率可以達(dá)到100%。從鑒定效率角度上看，基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹可以將蒲黃與其混偽品明顯分開，但香蒲屬下種級物種間并沒有很好的區(qū)分，這可能與香蒲屬植物的親緣關(guān)系較近有關(guān)。而從蒲黃藥材的角度來看，《中國藥典》2010年版規(guī)定蒲黃為同屬植物花粉均可，所以對于蒲黃鑒定到屬級別已可實(shí)現(xiàn)其與混偽品的準(zhǔn)確鑒定。對于松花粉而言，由于種內(nèi)均無變異位點(diǎn)，并且經(jīng)過序列分析后發(fā)現(xiàn)3個(gè)物種間僅在74 bp處有一變異位點(diǎn)，未定種的樣品序列（YC0405MT02～04）與油松、黃山松（JF829701）、臺灣松（JF829712）序列相同，暫不能鑒定到種，但從松花粉藥材的角度來看，其鑒定到屬級別已滿足市場的需求。

本研究在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蒲黃藥材的測序結(jié)果中存在套峰的情況，這可能是由于所購的藥材為多種植物花粉的混合物或者是多拷貝基因的存在所導(dǎo)致的^[28]。此外，購買的蒲黃藥材檢測為水稻，且摻偽藥材份數(shù)占蒲黃藥材總數(shù)的27.27%，一方面說明藥材的摻偽情況可以通過DNA條形碼技術(shù)檢測出來，同時(shí)確定混用或摻偽的具體混偽品；另一方面說明了在市場上蒲黃摻偽情況突出。這有可能影響蒲黃的藥效甚至是影響到用藥者的健康，因此相關(guān)部門應(yīng)該加大蒲黃藥材的監(jiān)管力度。endprint

本文采用DNA條形碼技術(shù)，基于ITS2序列，對60份蒲黃、松花粉及其混偽品樣品進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的蒲黃ITS2引物PhF-R的擴(kuò)增效率高達(dá)100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定蒲黃、松花粉及其混偽品。此研究為花粉類中藥材的鑒定提供了新思路，為藥材原料的準(zhǔn)確采購、市場流通及質(zhì)量監(jiān)管提供了新的技術(shù)手段。

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Identification of cattail pollen （Puhuang），pine pollen （Songhuafen） and

its adulterants by ITS2 sequence

MA Xiao-xi1，2，SUN Wei2，REN Wei-chao2，XIANG Li2，ZHAO Bo2，ZHANG Ya-qin1，

SONG Ming1，MU Ze-jing3，CHEN Shi-lin2*

（1. School of Chemical Engineering，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China；

2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；

3.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

[Abstract] DNA barcoding method was conducted for the authentication of pollen materials due to difficulty of discriminating pollen materials bearing morphological similarity. In this study，a specific focus was to identify cattail pollen （Puhuang） and pine pollen （Songhuafen） samples from their adulterants which are frequently mixed-together. Regions of the internal transcribed spacer （ITS2） from 60 samples were sequenced，and new primers for cattail pollen were designed according to the sequence information. The results from the NJ trees showed that the species of pine pollen，Puhuang and their adulterants can be classified as obvious monophyly. Therefore，we propose to adapt DNA barcoding methodology to accurately distinguish cattail pollen，pine pollen and their adulterant materials. It is a great help for drug regulatory agency to supervise the quality of medicinal materials.

[Key words] ITS2；cattail pollen；pine pollen；DNA barcode

doi：10.4268/cjcmm20141208endprint