JC病毒大T抗原及β-catenin在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)*

朱小寶 田小林 宋永攀 龐凌坤

(桂林醫(yī)學(xué)院 廣西桂林 541001)

結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展涉及多基因、多途徑的改變。篩選特異敏感的分子指標(biāo)用于結(jié)直腸癌的人群篩查，將對早期診斷和治療結(jié)直腸癌，降低結(jié)直腸癌罹患及減少患者死亡、延長生存時間均有重要意義。隨著對人類基因組不斷深入的研究,生物性致癌因子尤其是病毒性致癌因子在誘導(dǎo)人類腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中起到激活作用。近年諸多家研究證實(shí),JCV與人類腫瘤如腦腫瘤、胃癌、食管癌、肺癌、前列腺癌中均已證實(shí)上述結(jié)論[1～3]。但對于JCV在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍沒有統(tǒng)一的認(rèn)識。有研究報道人體細(xì)胞是JCV的半容許性細(xì)胞,即JCV存在于人結(jié)直腸腺癌組織中,但是否具有致癌性及其機(jī)理國外已有相關(guān)報道,國內(nèi)罕有JCV在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)及相關(guān)性深入的研究。β-catenin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后不良關(guān)系密切。胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥中均已證實(shí)上述結(jié)論[4～6]，即Wnt/β-catenin正常表達(dá)的罹癌患者，其預(yù)后要優(yōu)于那些Wnt/β-catenin表達(dá)上調(diào)的病人。這就提示W(wǎng)nt/β-catenin 表達(dá)可作患者預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物和早期診斷的重要候選生物分子指標(biāo)。本研究通過免疫組織化學(xué)及RT-PCR技術(shù)，結(jié)直腸腺癌組織JCV早期基因編碼產(chǎn)物大T抗原(T-Ag)與β-catenin在人結(jié)直腸腺癌組織中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集筆者所在單位2010年5月至2011年8月期間經(jīng)外科手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌(Colorectal carcinoma,CRC)組織標(biāo)本65例, 其中男42例，女23例，患者術(shù)前未做過化療和放療；20例結(jié)直腸非腫瘤標(biāo)本多為腸梗阻標(biāo)本，所有標(biāo)本均由兩位以上病理醫(yī)師確診。按病理組織學(xué)分級，其中高分化17例，中分化12例，低分化36例。按TNM分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期11例，Ⅲ期39例，Ⅳ期9例。非癌患者為腸梗阻正常腸黏膜20例為正常對照。

1.1.2 試劑 鼠抗人單克隆抗體SV40 T-Ag及β-catenin購自美國Sant Cruz公司,檸檬酸抗原修復(fù)液、S-p越敏免疫組化染色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。PCR引物，由Invitrogen英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；Trizol(美國Invitrogen 公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Fermentas公司，PCR試劑盒，北京天澤基因科技有限公司。

1.2 免疫組織化 S-P法操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。石蠟切片脫蠟、脫水、 檸檬酸高壓熱修復(fù),滴加一抗4℃過夜。順次滴加試劑1及試劑2在37℃孵育10min。染色步驟按說明書進(jìn)行。蘇木素輕度復(fù)染。二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。以已知標(biāo)準(zhǔn)陽性切片作為陽性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照ENAM[6]報道的方法。JCV T-Ag以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性(圖1)，按陽性細(xì)胞所占百分比評分(陽性細(xì)胞數(shù)的計算標(biāo)準(zhǔn)：觀察400個腫瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)/400×100%來計算)：1%～10% 為(-)，>10%～90%為(+)。β-catenin以細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性(圖2)。其中只有細(xì)胞膜β-catenin染色標(biāo)記(++) 為正常表達(dá);如細(xì)胞膜沒有表達(dá)或小于30%細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記(+) / (-) 判斷為表達(dá)減弱或表達(dá)喪失,即異常表達(dá)。(見圖3、圖4)

圖1 免疫組化 HP10*10

圖2 免疫組化 P10*10

圖3 JCV T-Ag在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)(*200)

圖4 β-catenin在非腫瘤結(jié)腸中的表達(dá)(*200)

1.3 定量RT-PCR檢測 取標(biāo)本組織約100 mg，置于研磨缽中加液氮研磨。用TRIzoI(美國Inviirogen公司)法提取總RNA，用DNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)反轉(zhuǎn)錄合成DNA。分別擴(kuò)增β-catenin和JCV。β-catenin PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min， 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；JCV PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min， 95℃變性45 s，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)；PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

總體積為20 μL

2×Taq PCR Master Mix(μL)10rTaq酶(μL)0.15上游引物(μL)1下游引物(μL)1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(μL)3ddH2O(μL)4.85

引物序列：

JCV上游引物 5'- ATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC-3' 下游引物 5'- AGTTCTTGGAGACACCCCCTACAG-3'合成產(chǎn)物長度為154 bpβ-catenin上游引物 5'- TGAGGACAAGCCACAAGATTAC-3'下游引物 5'- TCCACCAGAGTGAAAAGAACG-3'合成產(chǎn)物長度為180 bp

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織與正常組織JCV T-Ag、β-catenin在結(jié)直腸腺癌、正常腸黏膜中的表達(dá)情況(免疫組化數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表) PCR結(jié)果現(xiàn)示：65例結(jié)直腸癌標(biāo)本中JCV T-Ag陽性表達(dá)35例，陽性率為66.15%(43/65)；β-catenin蛋白陽性表達(dá)率為63.07%(41/65)；而癌旁正常組織標(biāo)本中JCV幾乎不表達(dá)，癌組織表達(dá)水平明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)

表1 JCV T-Ag、β-catenin表達(dá)與結(jié)直腸腺癌病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 討 論

JCV屬多瘤病毒屬多瘤病毒科病毒，主要包括JCV、BKV、SV40三種病毒，人群對其普遍易感，血清總成陽性率約為81%、35%、5%。感染后一般無臨床癥狀，但可以潛伏于腎臟和泌尿道上皮細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞中[7]，它繁殖到一定的量時通過尿液排出體外。有研究證明[8]，JCV通過與細(xì)胞表面表達(dá)的α-2,6-連接唾液酸附著，與細(xì)胞表面表達(dá)的5-羥色胺2α亞型受體結(jié)合后才能對人類細(xì)胞進(jìn)行感染，通過細(xì)胞膜表面含唾液酸殘基的糖蛋白受體結(jié)合，以包涵體依賴的方式進(jìn)入細(xì)胞，并通過微絲、微管、中間纖維等細(xì)胞骨架蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。T-抗原是JCV感染早期基因表達(dá)的蛋白，它在致癌作用上有著明顯的差異。T-抗原具有多功能的磷酸蛋白，主要存在于核中，該抗原被認(rèn)為是調(diào)節(jié)JC病毒的致癌重要因素[9]。Boltin研究[10]通過實(shí)時PCR測定JC病毒T-抗原，結(jié)果顯示其在結(jié)腸癌和腺瘤中的含量比對照組或正常結(jié)腸黏膜高。JC病毒T-抗原通過p53和pRb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤敏感性蛋白)結(jié)合，進(jìn)一步介導(dǎo)DNA復(fù)制促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因而T-抗原被認(rèn)為在JC病毒致癌中起著重要的作用。T -抗原是非磷酸化蛋白，存在于感染細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并非必須，但可起加強(qiáng)作用。T-Ag與pRb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤敏感性蛋白)結(jié)合置換了E2F，從而促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)程和致癌轉(zhuǎn)換細(xì)胞不增殖的特點(diǎn)。從pRb上釋放的E2F通常刺激了p14ARF的表達(dá)，p14ARF能導(dǎo)致p53的穩(wěn)定性。T-Ag可直接鑲嵌到β-catenin上，并引起其堆積，因此該蛋白改變其位置到核上并在核內(nèi)增強(qiáng)原癌基因(c-myc)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D的表達(dá)，是典型的反Wnt信號路徑[11]。

Wnt信號在多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號通路中的核心蛋白，當(dāng)Wnt信號通路被激活后，該蛋白在細(xì)胞質(zhì)持續(xù)增加，并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEFs結(jié)合，從而激活多種基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[12]。β-catenin的主要功能之一是通過和E-cadherin結(jié)合成E-cadherin/catenins復(fù)合體來維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞之間的粘附作用。各種因素導(dǎo)致β-catenin的結(jié)構(gòu)破壞時將導(dǎo)致其降解發(fā)生障礙，在細(xì)胞內(nèi)的含量增加引起E-cadherin/catenins復(fù)合體的功能障礙，使細(xì)胞的完整性和粘附功能受到破壞，從而引起腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Wnt通路受多種細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白和Wnt抑制因子(wIF)可直接抑制Wnt配體與受體結(jié)合從而抑制Wnt信號通路，DKK家族可通過結(jié)合LRPSl6抑制Wnt信號傳導(dǎo)。在正常情況下Wnt信號處于失活狀態(tài)，一旦Wnt通道被激活將會引起β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和胞核內(nèi)異常表達(dá)使下游的基因出現(xiàn)異常，最終引起腫瘤的發(fā)生[13]。

本研究旨在通過RT-PCR技術(shù)來觀察JCV及β-catenin在結(jié)直腸癌標(biāo)本中的表達(dá)情況，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：①JCV在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高，而正常組織中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，57%～83%來源于膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤和約50%的小兒髓母細(xì)胞瘤中存在JCV DNA和T抗原的表達(dá)[14]。我們可以從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明JCV與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，并在結(jié)直腸癌的演變過程中發(fā)揮著重要的作用。但是不同年齡、不同部位腫瘤及不同程度的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。②β-catenin在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著高于正常組織，低分化結(jié)直腸癌中明顯高于高分化腺癌，同時淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌(P<0.05)。綜上所述，我們可以推測：JCV的表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性有關(guān)，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過檢JCV的表達(dá)，可為結(jié)直腸癌的診斷提供一定的依據(jù)。β-catenin異常表達(dá)可能是結(jié)直腸癌中E-鈣蛋白/連還蛋白復(fù)合體功能異常的結(jié)果，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌獲得較強(qiáng)的侵襲能力，極易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。通過檢測β-catenin為今后臨床防治結(jié)直腸癌的診斷、復(fù)發(fā)提供依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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