復(fù)合菌劑預(yù)處理玉米秸稈及厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣

夏禹周, 李海紅, 李紅艷, 王 巧, 閆志英

(1.陜西省現(xiàn)代建筑設(shè)計(jì)研究院， 陜西 西安 710048; 2.西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 陜西西安 710048; 3.中國(guó)科學(xué)院 成都生物研究所, 四川 成都 610041)

0 引言

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)生農(nóng)作物秸稈多達(dá)7.6億噸，其中稻草、玉米稈和小麥稈的數(shù)量約占秸稈總量的75 %.在秸稈利用方面，秸稈還田、飼用、燃燒及其它利用方式所占比例分別為24.3%、29.9%、35.3%和10.5%[1,2],其資源化問(wèn)題已成為了研究的熱點(diǎn).

秸稈發(fā)酵制沼是一種將秸稈等有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為可替代的清潔能源的技術(shù)，為秸稈資源化提供了一種有效途徑.但發(fā)酵產(chǎn)氣過(guò)程多受發(fā)酵原料的限制，主要原因是秸稈中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量高，大分子相互纏結(jié)難以降解，厭氧菌消化困難，導(dǎo)致發(fā)酵啟動(dòng)慢，產(chǎn)氣效率低[3,4].故需對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理，以破壞秸稈內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)，提高厭氧消化效率和產(chǎn)氣量.

目前，生物預(yù)處理被證明是木質(zhì)素降解的有效途徑[5].Karmakar S等[6]指出，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌，盡管活性較高，但降解效果不如混合微生物菌群的共同作用.所以，近年來(lái)利用生物復(fù)合菌劑對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理的研究備受關(guān)注.

本研究對(duì)4類(lèi)復(fù)合菌劑進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，利用正交助手得到9組不同配比的復(fù)合菌劑.以玉米秸稈為原料，采用復(fù)合菌劑預(yù)處理秸稈，研究秸稈失重率以及木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的降解率.再利用預(yù)處理后的秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣，研究整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)氣特性，探索不同復(fù)合菌劑對(duì)秸稈降解以及發(fā)酵產(chǎn)沼氣的效果，為秸稈生物燃?xì)夤こ痰脑O(shè)計(jì)與運(yùn)行提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵材料玉米秸稈、接種物豬糞等均取自四川雙流縣太平鎮(zhèn)郊區(qū)農(nóng)民家里.復(fù)合菌種分為4類(lèi)，即混合菌為一類(lèi),2株真菌(HX-1 和YJ-1-1)為一類(lèi),2株放線菌(Q0和2-9)+1株細(xì)菌Q3為一類(lèi),綠色木霉為一類(lèi).目標(biāo)菌共7株，皆為實(shí)驗(yàn)室選育所得.

1.2 菌種拮抗實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，牛肉膏3 g，酵母粉3 g，蛋白胨10 g，MgSO4·7H2O22 g， 自然pH，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL.

1.2.1 真菌拮抗實(shí)驗(yàn)

將3種真菌(HX-1、YJ-1-1、綠色木霉)兩兩對(duì)點(diǎn)接種到同一培養(yǎng)基平板上，接種點(diǎn)之間的距離為3 cm，35 ℃下培養(yǎng)，觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，看其能否相容.

1.2.2 牛津杯法

混合菌、放線菌及細(xì)菌等不像真菌那樣能蔓延生長(zhǎng)，按參考文獻(xiàn)[7]的牛津杯法兩兩進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)(一個(gè)平板上共3個(gè)平行樣).在培養(yǎng)過(guò)程中，如果兩種菌相容，牛津杯周?chē)蜎](méi)有透明圈；如果兩種菌不能相容，牛津杯周?chē)蜁?huì)產(chǎn)生透明圈.

1.3 菌種配比

利用正交助手設(shè)計(jì)軟件，將4類(lèi)菌種進(jìn)行組合，得到9組不同的配比.把7株菌按照一定的比例混合，得到9組不同的復(fù)合菌液備用.各組編號(hào)記為A1、B2、…、I9,對(duì)照組記為J10.

1.4 秸稈堆漚預(yù)處理

預(yù)處理秸稈共10組，9組加不同配比的菌劑，1組不加菌劑作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)編號(hào)和菌劑編號(hào)一致.每組秸稈(尺寸為1 cm左右)75公斤，按干秸稈量的0.5%加入復(fù)合菌劑，同時(shí)加尿素1公斤、并補(bǔ)加水至樣品含水率約為70%，混合均勻后堆漚預(yù)處理6 d.然后，在6 d后采用范氏法(見(jiàn)文獻(xiàn)[8])測(cè)定秸稈木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率.

1.5 厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣

選用500 mL廣口瓶作為發(fā)酵瓶，發(fā)酵原料包括預(yù)處理秸稈、豬糞(氮源補(bǔ)充物)、水等.加入的接種物為發(fā)酵原料的20%，補(bǔ)加水量，使發(fā)酵液的總固體濃度(TS)為8%，將發(fā)酵原料混合均勻，投加于發(fā)酵裝置中，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵30 d.每日采用安捷倫7890A氣相色譜儀測(cè)定甲烷濃度，采用排水集氣法測(cè)定產(chǎn)氣量.

實(shí)驗(yàn)分為10個(gè)組.其中，9組為經(jīng)不同復(fù)合菌劑處理后的秸稈發(fā)酵，1組為未經(jīng)菌劑處理后的秸稈發(fā)酵.每組3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)編號(hào)和菌劑編號(hào)一致.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在真菌培養(yǎng)基平板上的第2 d就可長(zhǎng)出菌絲，第3 d就可相互融合生長(zhǎng)，如圖1所示.平板上的紅色是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中加入了0.03%的孟加拉紅，便于觀察.圖1(a)與圖1(b)表明，三種真菌之間均無(wú)拮抗，可以混合生長(zhǎng).

(a)真菌HX-1和YJ-1-1

(b)真菌YJ-1-1和綠色木霉圖1 真菌拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其它菌種的牛津杯周?chē)紱](méi)有透明圈產(chǎn)生，如圖2所示.這說(shuō)明菌株彼此也可以共同生長(zhǎng).因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)這7種菌株進(jìn)行混合配比.

圖2 混合菌和放線菌Q0拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌種配比

根據(jù)正交助手設(shè)計(jì)軟件獲取菌種配比，以體積比為指標(biāo)，菌液濃度相同.配比結(jié)果如表1所示.

表1 菌種配比(體積比)

2.3 預(yù)處理秸稈失重結(jié)果

秸稈堆漚過(guò)程中，堆體的初始溫度為35 ℃，到第3 d溫度上升且開(kāi)始基本穩(wěn)定在55 ℃～62 ℃.隨著溫度上升，菌體生長(zhǎng)旺盛，復(fù)合菌劑加速秸稈降解.當(dāng)溫度穩(wěn)定時(shí)，堆漚環(huán)境成熟，秸稈降解速率穩(wěn)定.此時(shí),根據(jù)秸稈前后質(zhì)量及含水率計(jì)算秸稈失重，其結(jié)果如圖3所示.

圖3 預(yù)處理秸稈失重率

從圖3可知，9組實(shí)驗(yàn)組的秸稈失重率依次為6.31%、14.2%、21.79%、26.61%、18.71%、23.97%、13.5%、14.71%、25.38%，對(duì)照組的秸稈失重率為12.16%.

其中,D4組的秸稈失重率最高，比對(duì)照組失重率高出1倍多.這說(shuō)明D4組配比得到的復(fù)合菌劑具有較強(qiáng)的秸稈降解能力，能有效利用秸稈中的木質(zhì)纖維成分，造成秸稈的質(zhì)量減少.其次為I9組，而A1組的失重率最低，這是因?yàn)榻斩挶砻鏁?huì)附著少量自然環(huán)境中的菌體，這種菌體比A1組復(fù)合菌劑對(duì)以秸稈為基質(zhì)的生存環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力.

2.4 預(yù)處理秸稈木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解率

堆漚預(yù)處理第6 d，菌劑預(yù)處理后的秸稈表面布滿了較多的白色菌絲，秸稈變得更為疏松柔軟，說(shuō)明秸稈中的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)已被菌劑中含有的纖維素、木質(zhì)素等高效分解菌破壞.通過(guò)范氏法測(cè)定秸稈中木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的降解效率，其結(jié)果如圖4所示.

圖4 預(yù)處理秸稈木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解率

從圖4中可以看出，10組秸稈組分的降解率皆為：半纖維素>木質(zhì)素>纖維素.這是因?yàn)橛衩捉斩捴械睦w維素、半纖維素不但被木質(zhì)素包裹，而且部分半纖維素和木質(zhì)素以共價(jià)鍵結(jié)合，形成緊密的結(jié)構(gòu).木質(zhì)素[9]是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的復(fù)雜芳香族高聚體，屬于非水溶性難降解物質(zhì)，而木質(zhì)素的包裹對(duì)水解纖維素起到屏障作用，阻礙了纖維素碳水化合物的酶解，所以纖維素的降解效率最低.而半纖維素主要由糖類(lèi)物質(zhì)組成，屬于易降解物質(zhì)，所以預(yù)處理過(guò)程中保持較高的降解率.

其中，D4組的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率最高，依次為46.16%、38.60%、53.14%，其次為I9組，降解率最低為A1組，不及對(duì)照組的降解率.這三種物質(zhì)的降解率與秸稈失重率相對(duì)應(yīng).這說(shuō)明不同菌劑配比對(duì)秸稈的預(yù)處理效果不一樣.D4組的復(fù)合菌劑較其它菌劑組合，對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素有很強(qiáng)的分解破壞能力，更容易轉(zhuǎn)變并利用木質(zhì)纖維素，提高秸稈在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中的可利用性.

2.5 厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣

2.5.1 復(fù)合菌劑對(duì)秸稈產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量是厭氧消化過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù)，直觀地反映了厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能，是判斷厭氧消化過(guò)程好壞的重要依據(jù).30 d的厭氧發(fā)酵周期內(nèi)，10組秸稈發(fā)酵的日產(chǎn)氣量及累計(jì)產(chǎn)氣量結(jié)果分別如圖5、圖6所示.

發(fā)酵瓶從進(jìn)料開(kāi)始，到能夠正常而穩(wěn)定的產(chǎn)氣過(guò)程稱(chēng)為沼氣發(fā)酵的啟動(dòng)[10].從圖5可以看出，裝料當(dāng)天即開(kāi)始產(chǎn)氣，表明10組秸稈在常溫下均能很快啟動(dòng)厭氧發(fā)酵.這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是在夏末季節(jié)進(jìn)行的，氣溫較高(室溫24 ℃～30 ℃)，利于菌群生長(zhǎng).裝料后第2 d出現(xiàn)了第一個(gè)產(chǎn)氣高峰期，主要成分為CO2.A1組至J10組的日產(chǎn)氣量依次為：457 mL/d、535 mL/d、765 mL/d、552 mL/d、562 mL/d、670 mL/d、520 mL/d、640 mL/d、950 mL/d、795 mL/d.其中，I9組預(yù)處理后的秸稈日產(chǎn)氣量最大，而A1組產(chǎn)氣量最少.在發(fā)酵初期， 發(fā)酵原料中的豬糞被復(fù)合菌群迅速利用而不斷減少，同時(shí)秸稈中的纖維素還沒(méi)有被完全降解利用，因此發(fā)酵料液的日產(chǎn)氣量逐漸下降.

隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，秸稈中的纖維素被不斷降解，甲烷菌的活性提高，進(jìn)而出現(xiàn)了第2個(gè)產(chǎn)氣高峰.第2個(gè)產(chǎn)氣高峰期各組出現(xiàn)時(shí)間不一致，大致在13～20 d內(nèi).A1組至J10組分別于第19 d、第17 d、第13 d、第18 d、第19 d、第13 d、第19 d、第20 d、第15 d、第14 d時(shí)的日產(chǎn)氣量達(dá)到最高，分別為442 mL/d、454 mL/d、514 mL/d、478 mL/d、476 mL/d、500 mL/d、449 mL/d、457 mL/d、609 mL/d、473 mL/d.其中I9組最高，高出對(duì)照組28.8%.

圖5 30 d發(fā)酵日產(chǎn)氣量

玉米秸稈的產(chǎn)氣率與其纖維素、木質(zhì)素、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量等相關(guān)，與細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、纖維含量呈負(fù)相關(guān).此外，秸稈細(xì)胞壁的組成也直接影響纖維素的消化率[11].從圖6可知，秸稈發(fā)酵30 d內(nèi)，I9組的累積產(chǎn)氣量最高，為10 413 mL，這和此秸稈經(jīng)過(guò)I9復(fù)合菌劑降解后，細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、纖維素含量大幅度下降有關(guān)，如圖3所示.秸稈結(jié)構(gòu)變疏松，纖維素、半纖維素與微生物的接觸面增大，易降解物質(zhì)量相應(yīng)提高，導(dǎo)致其消化率明顯提高，產(chǎn)氣量上升；累積產(chǎn)氣量最低的組為第7組，為6 540 mL，J10對(duì)照組為7 623 mL.9組實(shí)驗(yàn)組中只有I9、F6、C3組累積產(chǎn)氣量比對(duì)照組高， 分別高出36.6.%、14.4%、8.3%.

圖6 30 d發(fā)酵總產(chǎn)氣量

實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，采用合適的菌劑配比預(yù)處理秸稈能很大程度地提高沼氣產(chǎn)生量.秸稈的生物預(yù)處理實(shí)際就是利用自然環(huán)境中的沼氣微生物將纖維素等原料進(jìn)行分解，完成沼氣發(fā)酵過(guò)程中的液化和產(chǎn)酸兩個(gè)階段的任務(wù)，以縮短沼氣發(fā)酵的停滯期，加速沼氣發(fā)酵的全過(guò)程.

2.5.2 復(fù)合菌劑對(duì)秸稈產(chǎn)甲烷量的影響

經(jīng)過(guò)30 d的厭氧發(fā)酵，10組秸稈發(fā)酵的日產(chǎn)甲烷量結(jié)果如圖7所示.

圖7 30 d發(fā)酵日產(chǎn)甲烷量

沼氣是以CH4為主的一種混合型可燃?xì)怏w，在穩(wěn)定的發(fā)酵階段，沼氣的主要成分是CH4和CO2，還有少量的CO、H2S、O2、N2等氣體[12].從圖7中可以看出，10組秸稈在發(fā)酵第1 d時(shí)都能產(chǎn)CH4，但含量并不高，這是因?yàn)榘l(fā)酵初期，沼氣池中水解酶類(lèi)活性較高，纖維素等分解菌活躍，發(fā)酵體系產(chǎn)生的CO2量大，揮發(fā)性有機(jī)酸等中間產(chǎn)物多，所以沼氣中CH4含量偏低，反映了沼氣發(fā)酵啟動(dòng)階段的特征[13].

第2 d出現(xiàn)產(chǎn)CH4的第1個(gè)高峰期.其中，I9組預(yù)處理后的秸稈日產(chǎn)CH4量最大，為417 mL/d ，高出對(duì)照組19.1%，甲烷的體積分?jǐn)?shù)為44%.C3組次之.第2個(gè)高峰期大致在13～20 d，這和日產(chǎn)氣量的趨勢(shì)基本一致.C3、F6、I9組分別于第15 d、第16 d、第17 d時(shí)日產(chǎn)CH4量達(dá)到最高，分別為334 mL/d、334 mL/d、416 mL/d，高出對(duì)照組9.2%、9.2%、35.9%，其余組都不及對(duì)照組，且I9組的甲烷體積分?jǐn)?shù)為68%，達(dá)到了最大值.30 d內(nèi)，I9組的累積產(chǎn)甲烷量最多，達(dá)6 074 mL，高出對(duì)照組39.0%.這說(shuō)明復(fù)合菌劑預(yù)處理能較大地提高秸稈產(chǎn)氣量和消化效率，但降解率和產(chǎn)氣量并不成正比，降解率高可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)不足，產(chǎn)氣量減少.

3 結(jié)論

(1)菌種拮抗實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合菌、真菌、放線菌及細(xì)菌、綠色木霉等4類(lèi)復(fù)合菌種(7種菌株)之間無(wú)拮抗，能相互共生長(zhǎng)，混合配比后得到9組復(fù)合菌劑.

(2)復(fù)合菌劑預(yù)處理秸稈實(shí)驗(yàn)表明，D4組秸稈失重率及木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率最高，依次為26.61%、46.16%、38.60%、53.14%；其次為I9組，其值分別為25.38%、39.1%、35.5%、48.5%.10組預(yù)處理秸稈的木質(zhì)素降解率都大于纖維素降解率.

(3)秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣實(shí)驗(yàn)表明， I9菌劑處理后的秸稈發(fā)酵效果最好.在30 d發(fā)酵周期內(nèi)，出現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)氣和產(chǎn)CH4高峰期，其累積產(chǎn)氣量和產(chǎn)CH4量分別可達(dá)10 413 mL、6 074 mL，高出對(duì)照組36.6%、39.0%.說(shuō)明采用合適的菌劑配比預(yù)處理秸稈能較大地提高秸稈產(chǎn)氣量和消化率.

D4組的木質(zhì)纖維降解率雖最高，但產(chǎn)氣并不是最高的.說(shuō)明降解率和產(chǎn)氣量并不成正比，降解率高可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)不足，產(chǎn)氣量減少.因此，選擇最佳復(fù)合菌劑配比為I9組，即復(fù)合菌、真菌、放線菌及細(xì)菌、綠色木霉的體積比為3∶3∶2∶1.

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