納豆芽孢桿菌菌劑的制備工藝

張 雯， 李宏杰， 賈 鷗， 張 艷， 劉 蘭

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.華東醫(yī)藥集團(tuán)， 浙江 杭州 311000)

0 引言

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)是從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出來的菌種，俗稱納豆菌，是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種[1,2].納豆芽孢桿菌芽孢能耐酸、堿、高溫及擠壓，在酸性胃環(huán)境中能保持高度的穩(wěn)定性[3-5]；納豆菌在腸道中不增殖，只在腸道上段迅速發(fā)育轉(zhuǎn)變成代謝活躍的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞，增強(qiáng)以厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群的腸道正常菌群的生長(zhǎng)，促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[6,7].納豆菌不僅具有分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)的性能，使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機(jī)酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分，而且在納豆菌發(fā)酵納豆的過程中還發(fā)現(xiàn)了一些生理活性物質(zhì)，使納豆具有多種保健功能，如抗腫瘤、降血壓、抗菌等作用，還可預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高蛋白質(zhì)的消化率、抗氧化等[8-10].納豆菌發(fā)酵大豆生產(chǎn)的納豆能產(chǎn)生具有溶栓活性的納豆激酶，具有治療三高(高血糖，高血壓，高血脂)和溶解血栓的作用.目前，納豆作為保健品及藥品已日益受到人們的重視[11-14].然而，納豆發(fā)酵用菌種還未見有商品形式出售，發(fā)酵菌劑的研究也未見有報(bào)道，這在很大程度上制約了納豆的速釀及產(chǎn)品的推廣.本研究利用具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的納豆激酶生產(chǎn)菌株—納豆芽孢桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，并進(jìn)行納豆芽孢桿菌菌劑制備，研究其生產(chǎn)工藝.為開發(fā)納豆菌產(chǎn)品及納豆速釀技術(shù)，促進(jìn)納豆的工業(yè)化生產(chǎn)及家庭使用，使納豆成為價(jià)廉易得的保健食品奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)，陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；種子培養(yǎng)基[15]蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%；普通發(fā)酵培養(yǎng)基[15]蛋白胨2%，葡萄糖 1%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%，pH 7.0～7.2；固體培養(yǎng)基[15]蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%，瓊脂2%,凝血酶(10 U/mg) 北京鼎國(guó)生物制品有限責(zé)任公司；標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原(Fibrinogen，Sigma F-8630),北京拜爾迪生物公司；注射用尿激酶凍干粉(u-PA，2 500 IU/mg),遼寧天龍制藥；黃豆,市售；其他試劑均為分析純.

MG250B電熱恒溫培養(yǎng)箱、HYG-1A恒溫振蕩器,上海新瑞儀器有限公司；XPS-8CA光學(xué)顯微鏡,上海光學(xué)儀器有限公司；BS110S精密電子天平,北京賽多利斯天平有限公司；752型紫外分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì),上?，槴\試驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

大豆浸汁培養(yǎng)基：黃豆以5倍水體積浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa處理1 h，濾除黃豆，取豆水，冷卻調(diào)節(jié)pH至中性；大豆發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆以5倍水體積浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa處理1 h，濾除豆水，取黃豆.

1.2.2 納豆激酶活力測(cè)定

納豆激酶活力的測(cè)定方法見文獻(xiàn)[16]和[17].

1.2.3 納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1)普通發(fā)酵培養(yǎng)基與大豆浸汁培養(yǎng)基發(fā)酵納豆芽孢桿菌的比較

制備普通發(fā)酵培養(yǎng)基、大豆浸汁培養(yǎng)基，分裝于250 mL錐形瓶中(裝液量30 mL/瓶)，接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，分別于37 ℃搖瓶培養(yǎng)10 h、12 h、14 h.600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光值.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

(2)大豆酸水解對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

按1.2.1所述方法制備大豆浸汁培養(yǎng)基，高溫高壓處理時(shí)介質(zhì)分別為0.05%，0.1%，1%，3%，6%的HCl溶液，以水介質(zhì)為對(duì)照.處理后的大豆浸汁培養(yǎng)基接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，分別于37 ℃搖瓶培養(yǎng)10 h、12 h、14 h.600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光值，研究大豆酸水解工藝對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

(3)大豆浸汁培養(yǎng)基配方的確定

制備大豆浸汁培養(yǎng)基，分別添加1%葡萄糖、3%葡萄糖、5%葡萄糖、0.02% K2HPO4、0.04%K2HPO4、0.06%K2HPO4，接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，37 ℃搖瓶培養(yǎng)14 h.600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光值，對(duì)大豆浸汁培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

1.2.4 納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

(1)溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

制備優(yōu)化大豆浸汁培養(yǎng)基，分裝于250 mL錐形瓶中(裝液量30 mL/瓶)，接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，分別于34 ℃、37 ℃、40 ℃搖瓶培養(yǎng)14 h.600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光值，研究溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

(2)pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

制備優(yōu)化大豆浸汁培養(yǎng)基，分裝于250 mL錐形瓶中(裝液量30 mL/瓶)，調(diào)節(jié)初始pH分別為pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8，接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，37 ℃搖瓶培養(yǎng)14 h.600 nm下測(cè)定發(fā)酵液吸光值，研究溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

(3)發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

制備優(yōu)化大豆浸汁培養(yǎng)基，分裝于250 mL錐形瓶中(裝液量30 mL/瓶)，接種納豆芽孢桿菌種子液(接種量10%)，37 ℃搖瓶培養(yǎng)14 h.發(fā)酵過程中，每隔1 h取發(fā)酵液于600 nm下測(cè)定吸光值，繪制納豆芽孢桿菌發(fā)酵曲線，確定納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

1.2.5 保護(hù)劑對(duì)納豆芽孢桿菌噴霧干燥的影響

利用上述優(yōu)化工藝發(fā)酵納豆芽孢桿菌，發(fā)酵液中分別添加β-環(huán)糊精、可溶性淀粉、蔗糖及脫脂奶粉4種物質(zhì)作為保護(hù)劑，4種保護(hù)劑分別選取5%、10%、15%的濃度進(jìn)行添加.利用噴霧干燥機(jī)對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口溫度為120 ℃，出口溫度為60 ℃～70 ℃，收集固形物，即得納豆激酶發(fā)酵菌劑.制備平板培養(yǎng)基，將菌劑進(jìn)行懸浮稀釋后進(jìn)行平板培養(yǎng)，計(jì)算菌劑中活菌數(shù)含量，研究保護(hù)劑對(duì)納豆芽孢桿菌噴霧干燥的影響.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

1.2.6 儲(chǔ)存時(shí)間及條件對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑發(fā)酵活力的影響

采用上述優(yōu)化工藝制備納豆芽孢桿菌菌劑，分別于室溫及4 ℃下儲(chǔ)存0 d、5 d 、15 d、30 d、60 d，取適量菌劑活化并制備種子液，接種大豆發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃靜態(tài)發(fā)酵5 d得成熟納豆，測(cè)定納豆激酶活力，研究?jī)?chǔ)存時(shí)間及條件對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑發(fā)酵活力的影響.每組試驗(yàn)3個(gè)平行.

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)均用三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值表示，用SPSS(PASW Statistics18)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次平行試驗(yàn)的平均值，方差分析及多重比較中p<0.05為顯著差異，記為*.

2 結(jié)果與討論

2.1 普通發(fā)酵培養(yǎng)基與大豆浸汁培養(yǎng)基發(fā)酵納豆芽孢桿菌的比較

普通發(fā)酵培養(yǎng)基與大豆浸汁培養(yǎng)基發(fā)酵納豆芽孢桿菌的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.結(jié)果表明，大豆浸汁培養(yǎng)基發(fā)酵所得納豆芽孢桿菌菌體濃度明顯高于普通發(fā)酵培養(yǎng)基.大豆中含有豐富的大豆蛋白，各類脂肪，和棉籽糖、水蘇糖等碳水化合物，維生素B1、維生素B2、煙酸等B族維生素，亞麻酸等不飽和脂肪酸以及多種微量元素.高溫高壓處理所得大豆浸汁能夠?yàn)榧{豆芽孢桿菌提供全面豐富的營(yíng)養(yǎng)，使納豆芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中迅速增殖，達(dá)到較高的菌體濃度.同時(shí)制備大豆浸汁培養(yǎng)基過程中產(chǎn)生的蒸煮大豆可作為后續(xù)納豆發(fā)酵原料，可以降低生產(chǎn)成本，適合于納豆芽孢桿菌菌劑及納豆發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn).

圖1 大豆浸汁培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵納豆芽孢桿菌細(xì)胞濃度比較

圖2 大豆酸水解對(duì)納豆芽孢桿菌細(xì)胞濃度的影響

2.2 大豆酸水解對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

大豆酸水解對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同濃度的鹽酸溶液對(duì)大豆進(jìn)行水解后所制得的大豆浸汁培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)納豆芽孢桿菌所得菌體濃度均較低，并且隨著水解時(shí)鹽酸濃度的升高，發(fā)酵所得納豆芽孢桿菌菌體濃度呈顯著下降的趨勢(shì).分析原因，可能是因?yàn)楦邷馗邏簵l件水解過程中，大豆中的營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)能夠充分游離出，經(jīng)過鹽酸水解后反而破壞了部分營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)水解過程中可能產(chǎn)生了毒副物質(zhì)，抑制了納豆芽孢桿菌菌體細(xì)胞的繁殖，因此大豆浸汁培養(yǎng)基制備時(shí)不采用酸水解處理.

2.3 大豆浸汁培養(yǎng)基配方的確定

2.3.1 葡萄糖加量對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

大豆浸汁培養(yǎng)基中葡萄糖加量對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響結(jié)果如圖3所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆浸汁培養(yǎng)基中添加葡萄糖能夠促進(jìn)納豆芽孢桿菌菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，葡萄糖濃度在5%以下時(shí)，隨著葡萄糖添加量的增加，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度呈上升趨勢(shì)，葡萄糖濃度繼續(xù)提高，大于5%時(shí)，菌體細(xì)胞濃度反而下降.說明大豆浸汁培養(yǎng)基中碳源含量不足，外源添加葡萄糖能夠作為碳源促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但濃度太高時(shí)，導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓過高，使細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離，不能正常繁殖.最終確定大豆浸汁中葡萄糖添加量為5%.

圖3 葡萄糖加量對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

圖4 磷濃度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.3.2 磷含量對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

大豆浸汁培養(yǎng)基中磷含量對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響結(jié)果如圖4所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆浸汁培養(yǎng)基中添加磷酸鹽能夠促進(jìn)納豆芽孢桿菌菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，K2HPO4含量在0.02%以下時(shí)，隨著磷含量的增加，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度呈上升趨勢(shì)，磷含量繼續(xù)提高，大于0.02%時(shí)，菌體細(xì)胞濃度反而下降.磷作為細(xì)胞內(nèi)核酸、磷脂、能量等物質(zhì)合成的重要原料，適量添加能夠促進(jìn)菌體細(xì)胞繁殖，但磷酸鹽含量過高時(shí)，會(huì)對(duì)糖代謝過程中的酶產(chǎn)生抑制作用，從而影響細(xì)胞內(nèi)正常代謝，影響細(xì)胞的繁殖.最終確定大豆浸汁中K2HPO4添加量為0.02%.

2.4 納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響結(jié)果如圖5所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，37 ℃以下，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度呈上升趨勢(shì),當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度顯著下降.細(xì)胞生長(zhǎng)速率取決于化學(xué)反應(yīng)速率以及酶活力的高低，隨著溫度的升高，化學(xué)反應(yīng)速率提高，但當(dāng)溫度高于酶活最佳溫度時(shí)，酶活力下降，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，影響細(xì)胞繁殖.納豆芽孢桿菌發(fā)酵溫度應(yīng)選擇37℃左右為宜.

圖5 溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

圖6 pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.4.2 pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響結(jié)果如圖6所示.pH影響細(xì)胞內(nèi)酶的催化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌發(fā)酵pH 在7.0左右時(shí)，發(fā)酵液中菌體細(xì)胞濃度最高.

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響結(jié)果如圖7所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液中菌體細(xì)胞濃度隨時(shí)間變化符合微生物細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律，發(fā)酵10 h時(shí)細(xì)胞濃度達(dá)最大值，之后進(jìn)入平衡期.分別取發(fā)酵10 h和14 h的菌體細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡鏡檢.結(jié)果表明，發(fā)酵10 h時(shí)，可觀察到大量桿狀菌體細(xì)胞，納豆芽孢桿菌基本以營(yíng)養(yǎng)體形式存在，發(fā)酵14 h時(shí)，菌體細(xì)胞開始老化、斷裂，芽孢開始出現(xiàn)，納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間應(yīng)選擇10 h左右為宜.

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.4.4 納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以發(fā)酵初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為影響因素，按表1進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定各因素對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌發(fā)酵最優(yōu)工藝為A2B2C2.三個(gè)因素中，發(fā)酵初始pH和發(fā)酵溫度影響顯著，發(fā)酵時(shí)間超過8 h后，影響較小.各因素對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵影響主次順序?yàn)锽>A>C，即發(fā)酵溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵影響最大，其次是發(fā)酵初始pH，發(fā)酵時(shí)間最小.正交試驗(yàn)結(jié)果表明納豆芽孢桿菌發(fā)酵最優(yōu)工藝為：發(fā)酵初始pH7，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 h.最優(yōu)組合A2B2C2不在正交試驗(yàn)表中，由此進(jìn)行最優(yōu)組合的驗(yàn)證試驗(yàn).發(fā)酵初始pH7，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 h條件下，發(fā)酵液OD600為1.030，高于正交試驗(yàn)各次試驗(yàn)納豆芽孢桿菌發(fā)酵液OD600，試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)論一致.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5 保護(hù)劑對(duì)納豆芽孢桿菌噴霧干燥的影響

保護(hù)劑對(duì)納豆芽孢桿菌噴霧干燥的影響結(jié)果如表3所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌發(fā)酵液噴霧干燥過程中，添加保護(hù)劑對(duì)菌體細(xì)胞具有保護(hù)作用.不添加保護(hù)劑時(shí)，噴霧干燥后菌劑所含活菌數(shù)為41 CFU/g，添加保護(hù)劑后，菌劑中活菌數(shù)明顯提高，5%脫脂奶粉作為保護(hù)劑噴霧干燥所得菌劑活菌數(shù)可達(dá)6.5×108CFU/g.蔗糖作為保護(hù)劑加入到發(fā)酵液中進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，隨著溫度升高逐漸焦化，幾乎起不到保護(hù)作用.

表3 不同保護(hù)劑對(duì)菌劑噴霧干燥的影響

2.6 儲(chǔ)存時(shí)間及條件對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑發(fā)酵活力的影響

儲(chǔ)存時(shí)間及條件對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑發(fā)酵活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌菌劑在25 ℃儲(chǔ)存時(shí)，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，菌劑發(fā)酵產(chǎn)酶活力降低，表明菌劑發(fā)酵活力隨著室溫儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì).這是因?yàn)槌貤l件下，菌體細(xì)胞仍繼續(xù)繁殖，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體細(xì)胞趨于老化，因此發(fā)酵活力降低.菌劑在4 ℃條件下儲(chǔ)存120天以內(nèi)，發(fā)酵活力變化不大，儲(chǔ)存時(shí)間達(dá)180 d，發(fā)酵產(chǎn)酶活力可保持在2 000 IU/g以上.因此，納豆芽孢桿菌菌劑宜冷藏儲(chǔ)存180 d以內(nèi).

圖8 儲(chǔ)存時(shí)間及條件對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑發(fā)酵活力的影響

3 結(jié)論

通過對(duì)納豆芽孢桿菌菌劑制備工藝進(jìn)行研究，最終得出結(jié)論如下：

(1)納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆浸汁培養(yǎng)基(黃豆以5倍水體積浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa處理1 h，濾除黃豆，取豆水，加入5%的葡萄糖和0.02%的K2HPO4，調(diào)節(jié)pH至7.0)；

(2)納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝：發(fā)酵初始pH7.0，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 h；

(3)噴霧干燥保護(hù)劑：5%脫脂奶粉；

(4)菌劑儲(chǔ)存：4℃冷藏180 d以內(nèi).

在上述工藝下所制得的納豆芽孢桿菌菌劑活菌數(shù)為6.5×108CFU/g，發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶性能良好.發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶酶活為2 000～2 200 IU/g.參考文獻(xiàn)

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