脯氨酰脯氨酸二肽的液相合成及表征

李運(yùn)濤， 范嬌嬌， 沈 文， 王 凡， 鄧?yán)罨?/p>

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 3.東華大學(xué) 纖維改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620)

0 引言

目前關(guān)于氨基酸二肽合成方法報(bào)道的主要有活潑酯法[4]、酰氯法[5]、混合酸酐法[6]、縮合劑法[7,8].縮合劑法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)速率高、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用縮合劑法在液相中合成脯氨酰脯氨酸二肽，其合成方案如圖1所示.本文通過(guò)正交試驗(yàn)探討了合成中關(guān)鍵步驟Ⅲ的最佳反應(yīng)條件，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了IR、1H NMR表征，通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、熱重分析研究了產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性能.

Ⅰ.氨基保護(hù) Ⅱ.羧基保護(hù) Ⅲ.肽鍵生成 Ⅳ.脫去羧基保護(hù)基 Ⅴ.脫去氨基保護(hù)基圖1 脯氨酰脯氨酸二肽合成路線圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑：脯氨酸(分析純)、N-羥基苯并三氮唑(HOBT，分析純)、三氟乙酸(TFA，化學(xué)純)、二碳酸二叔丁酯((Boc)2O，分析純)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，優(yōu)級(jí)純)，二氯甲烷(DCM，分析純)，其他試劑均為分析純.

儀器：VETER70型傅里葉紅外光譜儀(德國(guó)PE公司)；ADVANCEⅢ 400 MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；TGA Q500熱重分析儀(美國(guó)TA公司)；SHZ-III真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；WRS-數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密數(shù)字儀器廠).

1.2 合成步驟

1.2.1 N-叔丁氧羰基脯氨酸的合成

于250 mL三口燒瓶中依次加入90 mL 5%的NaOH溶液、90 mL 1.2 mol·L-1(Boc)2O的二氧六環(huán)溶液、11.5 g脯氨酸，室溫下攪拌反應(yīng)8 h，用薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)完全.減壓蒸餾除去溶劑，殘留物用蒸餾水稀釋.稀釋液在冰水浴條件下用2 mol· L-1鹽酸調(diào)至pH=3，分別用50 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用無(wú)水CaCl2干燥，減壓蒸餾至溶劑完全蒸干，得到白色晶體.

1.2.2 脯氨酸甲酯鹽酸鹽的合成

Nemati A, Wang Q, Hong M H, Teng J H. Tunable and reconfigurable metasurfaces and metadevices. Opto-Electronic Advances1, 180009 (2018).

于250 mL三口燒瓶中加入100 mL無(wú)水甲醇，開(kāi)動(dòng)攪拌，冰鹽浴(-5 ℃～-10 ℃)下，逐滴加入7.2 mL二氯亞砜，低溫反應(yīng)30 min；分批加入11.5 g脯氨酸，低溫反應(yīng)2 h.自然升至室溫繼續(xù)反應(yīng)8 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全.減壓蒸餾除去溶劑，得到白色晶體.

1.2.3 N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸甲酯的合成

于250 mL三口燒瓶中加入50 mL一定濃度的脯氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Pro-OMe·HCl)溶液，加入三乙胺調(diào)溶液至堿性，備用.于另一250 mL三口燒瓶加入50 mL等濃度的N-叔丁氧羰基脯氨酸溶液，冰水浴條件下加入一定量的催化劑及等量的DCC溶液，攪拌30 min后，將兩種溶液混合.攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全.反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去白色沉淀，濾液減壓蒸餾，將濃縮液溶于乙酸乙酯后再次抽濾.濾液依次用0.1 mol·L-1鹽酸、飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液各40 mL洗滌3次，用無(wú)水CaCl2干燥，減壓蒸除溶劑得到淡黃色油狀物.

1.2.4 N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸的合成

將4.34 g N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸甲酯溶于50 mL甲醇中，冰水浴條件下滴加20 mL10% NaOH溶液，攪拌反應(yīng)2 h.用2 mol·L-1鹽酸調(diào)pH=8，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物溶于水.水相在冰水浴條件下酸化至pH=3，溶液分別用50 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，依次用蒸餾水、10%的檸檬酸溶液以及飽和NaCl溶液各40 mL洗滌3次，有機(jī)層用無(wú)水CaCl2干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾除去溶劑，得到白色油狀物.

1.2.5 脯氨酰脯氨酸二肽的合成

將1.96 g N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸溶于20 mL含50%TFA的二氯甲烷溶液中，室溫?cái)嚢?0 min.減壓蒸餾除去溶劑，殘留物溶于20 mL水，分別用10 mL乙醚萃取水溶液中雜質(zhì)2次，水相用三乙胺調(diào)至pH=5，放置冰箱中24 h，析出白色針狀物，過(guò)濾、干燥，得目標(biāo)產(chǎn)物.

1.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

Ⅲ(肽鍵形成)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳反應(yīng)條件，正交試驗(yàn)選定5個(gè)影響因素[9]：A.溫度、B.時(shí)間、C.投料比(H-Pro-OMe·HCl與DCC的摩爾數(shù)之比)、D.催化劑、E.溶劑，試驗(yàn)中考察的各因素水平見(jiàn)表1.其中D、E為兩水平，其它各因素為四水平.為此，采用L16(44×23)混合水平正交表，其中前四列為四水平，后三列為二水平，根據(jù)表頭設(shè)計(jì)原則[10]，做出各因素的安排(見(jiàn)表2)，進(jìn)行16次試驗(yàn)，得出結(jié)果.

表1 因素水平表

1.4 產(chǎn)物表征

1.4.1 IR表征

分別對(duì)脯氨酸原料及目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜表征(KBr壓片法)，對(duì)波數(shù)在2 500～500 cm-1范圍內(nèi)的兩種化合物的紅外光譜圖進(jìn)行比較，分析考察各基團(tuán)的特征頻率.

1.4.21H NMR表征

對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振氫譜表征，分析化合物的結(jié)構(gòu)組成.

1.4.3 熔點(diǎn)測(cè)定

測(cè)定產(chǎn)物的熔點(diǎn)，考察產(chǎn)物純度.

1.4.4 TG測(cè)試

對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熱重分析，測(cè)試條件：N2保護(hù)，溫度范圍30 ℃～550 ℃，升溫速率10 ℃/min.考察產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性及熱分解溫度.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2為正交試驗(yàn)結(jié)果，由表2可得出試驗(yàn)在A4B4C3D2E1組合條件下產(chǎn)率最高，即反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時(shí)間20 h，投料摩爾比為1∶1.2， 催化劑為HOBT，溶劑為T(mén)HF.當(dāng)反應(yīng)溫度過(guò)低或過(guò)高，反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，DCC用量過(guò)低時(shí)，產(chǎn)率較低.這可能是因?yàn)榉磻?yīng)為可逆反應(yīng)，低溫不利于反應(yīng)正向進(jìn)行，而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致使反應(yīng)物不穩(wěn)定；縮合劑的量過(guò)低時(shí)使縮合物反應(yīng)不完全.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

列號(hào)ABCDE產(chǎn)率/%144231171.1154322178.2164442275.6T1219189217468498T=968T2213246222499470T=60T3256263263T4279268265

表3為正交試驗(yàn)方差分析表，考察了各因素對(duì)試驗(yàn)的顯著性影響.在顯著水平α=0.1時(shí)，F(xiàn)0.9(3,4)=4.19，F(xiàn)0.9(1,4)=4.54，F(xiàn)A>4.19，F(xiàn)B>4.19，可知因素A、B對(duì)產(chǎn)率有顯著性影響，其它各因素對(duì)產(chǎn)率影響不明顯.因此，從簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全等方面綜合考慮，選定A4B4C3D2E2組合，即反應(yīng)溫度為30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20h，投料比為1∶1.2，催化劑為HOBT，溶劑為DCM.按照選定的試驗(yàn)條件進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，平均產(chǎn)率達(dá)78%.

表3 方差分析表

2.2 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 IR分析

圖2為脯氨酸(曲線1)和Pro-Pro(曲線2)的紅外光譜圖，從圖中可看出，曲線1在1 675 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，歸屬于C=O伸縮振動(dòng)，在1 378 cm-1處吸收峰歸屬于C-O伸縮振動(dòng)，在1 198～1 127 cm-1范圍內(nèi)吸收峰為碳骨架的伸縮振動(dòng).曲線2在1 750 cm-1處的吸收峰歸屬于羧酸中C=O的伸縮振動(dòng)，1 689 cm-1處吸收峰歸屬于酰胺中C=O伸縮振動(dòng)，1 397 cm-1處為典型的酰胺中C-N的伸縮振動(dòng)，比較發(fā)現(xiàn)化合物中吸收峰均向高波數(shù)移動(dòng)[11]，表明Pro-Pro中四氫吡咯環(huán)具有較大張力，使環(huán)外化學(xué)鍵振動(dòng)加強(qiáng). 通過(guò)比較分析，證明了產(chǎn)物中酰胺鍵的存在.

圖2 脯氨酸和Pro-Pro的紅外光譜圖

2.2.21H NMR分析

圖3為Pro-Pro的1H NMR譜圖，從圖3可看出，δ=7.29處應(yīng)為結(jié)構(gòu)式中15位置上-OH質(zhì)子峰，由于羧酸中兩個(gè)O的屏蔽作用較強(qiáng)，使得質(zhì)子峰產(chǎn)生于低場(chǎng)；δ=3.35處應(yīng)為-NH中的質(zhì)子峰，因?yàn)镻ro-Pro中僅存在一個(gè)-NH基團(tuán)，導(dǎo)致峰強(qiáng)度較弱；δ=3.13～3.07處屬于結(jié)構(gòu)式中2、6位置上-CH2的質(zhì)子峰；δ=1.44～1.31應(yīng)為結(jié)構(gòu)式中1、3、5、7位置上-CH2的質(zhì)子峰；δ=3.13～3.07與δ=1.44～1.31兩處峰面積比為1.25∶2.01，與理論個(gè)數(shù)1∶2接近.

圖3 Pro-Pro的1H NMR及結(jié)構(gòu)式

2.3 熱穩(wěn)定性分析

2.3.1 產(chǎn)物熔點(diǎn)

經(jīng)熔點(diǎn)儀測(cè)定，N-叔丁氧羰基脯氨酸的熔點(diǎn)為134 ℃～136 ℃，脯氨酸甲酯鹽酸鹽的熔點(diǎn)為68 ℃～69 ℃ ，Pro-Pro的熔點(diǎn)為178 ℃～180 ℃，與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-14].產(chǎn)物的熔程在2 ℃ 范圍以?xún)?nèi)，說(shuō)明產(chǎn)物純度較高.

2.3.2 TG-DTG曲線

圖4為Pro-Pro的熱重及微商熱重曲線，由圖4可看出，Pro-Pro在155 ℃時(shí)重量開(kāi)始下降，此時(shí)可能為氨基脫落所致；在171 ℃～262 ℃之間，產(chǎn)物失重明顯，最大失重溫度為206 ℃，最大失重速率達(dá)2.2%/℃.當(dāng)溫度高于230 ℃時(shí)Pro-Pro已經(jīng)完全分解.表明Pro-Pro最高使用溫度為155 ℃.

圖4 Pro-Pro的熱重及微商熱重曲線

3 結(jié)論

(1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工藝條件，脯氨酰脯氨酸二肽中肽鍵生成的最佳條件：反應(yīng)溫度為30 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 h，投料量的摩爾比為1∶1.2， 催化劑為HOBT，溶劑為DCM，產(chǎn)率達(dá)78%.

(2)通過(guò)IR、1H NMR分析，證明成功合成了脯氨酰脯氨酸二肽；TG-DTG分析表明脯氨酰脯氨酸二肽最高使用溫度達(dá)155 ℃.在作為Aldol反應(yīng)中的催化劑方面有良好的應(yīng)用前景.

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