高效液相色譜法檢測金花菌固態(tài)發(fā)酵中他汀類物質(zhì)

呂嘉櫪， 王 珊， 王 柳

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

金花菌屬于益生菌，是茯磚茶“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌[1]，存在于茯磚茶斷面，呈大量肉眼可見的金黃色亮黃菌群狀[2].有研究證明金花菌發(fā)酵液表現(xiàn)出了強(qiáng)的調(diào)脂減肥功能[3-8].他汀類物質(zhì)為有效降血脂成分，呈白色針狀晶體，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、苯、堿性水溶液等[9、10].目前常用檢測方法有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法[11-13]，但研究對象大多集中于紅曲霉、土曲霉、青霉等霉菌代謝物的研究，而對金花菌的研究卻沒有涉及[14-16].

本文在前人對金花菌研究的基礎(chǔ)上對金花菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)， 通過HPLC法對金花菌乙酸乙酯提取液進(jìn)行他汀類物質(zhì)的快速準(zhǔn)確檢測，得到了最佳的色譜分析條件并測其含量，為優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供了一定的研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種

陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗室提供冠突散囊菌菌種.

1.2 材料

1.2.1 主要設(shè)備與試劑

(1)設(shè)備： KH-100B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海佳勝實(shí)驗設(shè)備有限公司)，SW-CG-1D型超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)，HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安微中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，UV-2600紫外分光光度計(龍尼柯儀器有限公司)，HPLC高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司).

(2)試劑：乙酸乙酯、甲醇、氯仿、氨水、碘等，均為分析純；甲醇，色譜純.

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基：分別稱取蔗糖4 g、NH4NO30.3g、K2HPO40.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 5 g、瓊脂2 g、水100 mL，121 ℃滅菌20 min.

(2)固體培養(yǎng)基：麩皮10 g，水7 mL，放入250 mL的三角瓶中，用玻璃棒攪拌使水分散均勻，121 ℃滅菌30 min.

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌的培養(yǎng)

取冰箱保藏菌種于28 ℃的斜面培養(yǎng)基CZG(5%NaCl)活化5 d，制備孢子菌懸液，孢子數(shù)106個/mL，吸取1 mL菌懸液接種于麩皮培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)7 d.

1.3.2 對照品溶液的制備

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取2 mg的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品，于10 mL的容量瓶中用甲醇溶液定容，超聲10 min使之溶解完全，配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3.3 樣品溶液的制備

稱取干燥的金花菌固體培養(yǎng)物適量，置于研缽中粉碎至細(xì)粉狀，稱取已粉碎好的金花菌粉末5 g置于500 mL試劑瓶中，按1∶20的料液比加入100 mL乙酸乙酯溶液，超聲20 min使之提取完全，過濾，重復(fù)上述操作2次，合并濾液，濾液中加入活性炭除色素后真空濃縮，用甲醇定容于25 mL的容量瓶中.于冰箱中放置24 h，底層沉淀，離心，取上清液，用0.45μL的有機(jī)濾膜過濾后待用.

1.3.4 HPLC色譜條件選擇

洛伐他汀易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯等溶液.提取劑的不同對洛伐他汀的提取影響很大，其中乙酸乙酯提取液中洛伐他汀含量提取率高，雜質(zhì)含量小，洛伐他汀峰與雜質(zhì)峰的分離度良好，且乙酸乙酯低沸點(diǎn)有利于后期濃縮，所以本實(shí)驗選用乙酸乙酯作為提取劑.

色譜柱型選擇C18柱.因為洛伐他汀在甲醇溶液中 48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，有利于保存，且酸型洛伐他汀不易轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯型洛伐他汀，色譜圖出峰良好，所以選擇甲醇∶水=80∶20為流動相.洛伐他汀紫外吸收峰分別為230 nm、 238 nm、246 nm，其中238 nm為最大吸收峰，所以檢測波長選擇238 nm.流速選擇1.0 mL/min.柱溫為室溫.進(jìn)樣量20μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 他汀類物質(zhì)色譜條件的影響

2.1.1 流動相種類的選擇

在室溫下，當(dāng)流動相比例為80∶20，流速1 mL/min時，分別使用甲醇∶水、甲醇∶磷酸水、乙腈∶水、乙腈∶磷酸水為流動相，記錄保留時間，如表1所示.由表1可知，得出的保留時間相差不大.

表 1 流動相種類的影響

圖2、圖4顯示加入磷酸水影響到洛伐他汀的轉(zhuǎn)型，出峰不穩(wěn)定且峰型雜亂；而圖1、圖3則顯示出峰型良好.所以在甲醇∶水和乙腈∶水等中，選擇了保留時間為15.419， 且無毒的甲醇∶水，從而使組分分離度良好.

圖1 流動相為甲醇：水的高效液相色譜圖

圖2 流動相為甲醇：磷酸水的高效液相色譜圖

圖3 流動相為乙腈：水的高效液相色譜圖

圖4 流動相為乙腈：磷酸水的高效液相色譜圖

2.1.2 流動相比例的選擇

在25 ℃室溫，1 mL/min流速，甲醇∶水為流動相，樣品溶液進(jìn)樣量為20μL等條件下，依次改變流動相比例，分別為70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10，得出保留時間為5.853、8.669、15.419、4.818、6.69，如表2所示.

當(dāng)比例為80∶20時，分離度良好，而時間低于10 min時，因出峰時間太快影響組分的分離，分離度較差，所以選擇80∶20為最佳流動相比例.

表2 流動相比例的影響

2.1.3 流速的選擇

在室溫25 ℃，甲醇∶水=80∶20等條件下，選擇不同的流速0.6 mL/min、0.8 mL/min、1 mL/min，進(jìn)樣20μL時，記錄保留時間，如表3所示.

從表3可得出結(jié)論：洛伐他汀組分的出峰時間隨著流速的增大而增大.雖然出峰時間越長分離度越好，但是會影響測定的效率.所以，本實(shí)驗選擇流速1 mL/min.

表3 流速的影響

2.1.4 柱溫的選擇

不同的溫度對洛伐他汀提取率影響較大，當(dāng)溫度低于25 ℃時，洛伐他汀提取率隨著溫度的增高逐漸增加；當(dāng)大于25 ℃時，提取率趨于平穩(wěn).同時，溫度過低影響組分的分離度，溫度過高影響測定效率.所以，不同溫度對洛伐他汀保留時間的影響如表4所示.

表4 柱溫的影響

保持甲醇∶水=80∶20的流動相，流速1 mL/min，從表4可得出結(jié)論：隨著溫度的增加，洛伐他汀保留時間延長，當(dāng)溫度為20 ℃時，洛伐他汀出峰時間為4.280，因時間太短，影響組分分離；37 ℃時，洛伐他汀的保留時間為52.809，保留時間太長，影響測定效率.所以，選擇室溫25 ℃為最佳測定溫度.

2.2 色譜條件結(jié)果

將洛伐他汀標(biāo)品、金花菌乙酸乙酯提取液按章節(jié)1.3.4所述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗，得出結(jié)果如圖5和圖6所示.

在HPLC過程中，采用簡單經(jīng)濟(jì)的流動相甲醇和水效果良好，圖5顯示洛伐他汀的保留時間為4.073 min，圖6中在相對應(yīng)的位置4.309處也有峰出現(xiàn).

所以，可以得出結(jié)論：金花菌乙酸乙酯提取液中有洛伐他汀物質(zhì)的存在，含量可以通過外標(biāo)法計算得知，得出洛伐他汀含量為0.049 mg/kg.同時，本實(shí)驗所使用金花菌發(fā)酵品為固態(tài)發(fā)酵初級制品，含色素較高，而洛伐他汀的含量較低.

圖5 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖6 金花菌固體培養(yǎng)物高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性相關(guān)性

分別量取章節(jié)1.3.2中配置的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL的稀釋溶液.

按章節(jié)1.3.4中所述高效液相色譜條件實(shí)驗，分別吸取以上稀釋溶液各 20μL，經(jīng) 0.45μL 微孔濾膜過濾后，注入液相色譜儀，記錄相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，以洛伐他汀濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1 513.4x+5 615.9，r2=0.996 1.且洛伐他汀的標(biāo)準(zhǔn)液濃度在2.0～30μg/mL時，與峰面積線性關(guān)系良好.標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示.

圖7 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 回收率

精密稱取4份金花菌固體培養(yǎng)物5.0 g，分別加入不同倍數(shù)的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，按章節(jié)1.3.3所述實(shí)驗條件制備樣品溶液，按章節(jié)1.3.4所述色譜條件進(jìn)樣，用加標(biāo)樣品的測定結(jié)果減去未加標(biāo)樣品的測定結(jié)果計算標(biāo)準(zhǔn)品的回收率，結(jié)果如表5所示.

表5 回收率

表5顯示，本實(shí)驗方法符合微量分析的要求.

2.3.3 精密度

精密量取0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行進(jìn)樣6次，記錄保留時間和相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，結(jié)果如表6所示.

表6 精密度

標(biāo)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%，該方法的精密度符合HPLC的定性要求.

2.3.4 重現(xiàn)性

精密稱取5份金花菌固體培養(yǎng)物5.0 g，在相同的實(shí)驗條件下對樣品進(jìn)行相同處理后按章節(jié)1.3.4所述的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，結(jié)果如表7所示.

表7 重現(xiàn)性

上述結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性符合要求.

3 結(jié)論

通過對陜西茯磚茶中金花菌的降脂類物質(zhì)的方法學(xué)驗證實(shí)驗，確定該菌種含有具備降脂功能的洛伐他汀，同時還確定了高效液相色譜法檢測金花菌固態(tài)發(fā)酵物中洛伐他汀的最佳色譜條件:即選用色譜柱C18柱，以甲醇∶水=80∶20為流動相，檢測波長238 nm.

該方法具有良好的線性關(guān)系和分離度，重現(xiàn)性好，平均回收率為99%，RSD為1.39%.本文對金花菌固態(tài)發(fā)酵樣品進(jìn)行測定，最高洛伐他汀含量為0.049 mg/kg.

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