施陶丁格連接在生物標記中的應(yīng)用

徐凡，郜炎龍，吳超柱，姜和，2

(1.重慶理工大學藥學與生物學院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

施陶丁格連接在生物標記中的應(yīng)用

徐凡1，郜炎龍1，吳超柱1，姜和1，2

(1.重慶理工大學藥學與生物學院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

在生物正交反應(yīng)中，疊氮化物和膦所進行的施陶丁格連接反應(yīng)在各種復雜的生物系統(tǒng)中扮演著重要的角色，如施陶丁格連接已被用于聚糖、脂類、DNA和蛋白質(zhì)的標記。此外，施陶丁格連接也作為一種合成方法用于構(gòu)造糖肽類、微陣型和功能性的生物大分子。在生物正交的新興領(lǐng)域中，各種最新的技術(shù)通常與施陶丁格連接樹立的高標準進行比較。綜述并總結(jié)了目前施陶丁格連接的發(fā)展和在生物標記領(lǐng)域中的應(yīng)用趨勢。

施陶丁格連接;疊氮化合物;生物正交反應(yīng);生物標記

1919 年，德國化學家赫爾曼·施陶丁格(Hermann Staudinger)首先發(fā)現(xiàn)并報道了疊氮化物和膦之間的反應(yīng)。直到最近幾年，Bertozzi教授及其團隊發(fā)現(xiàn)了該反應(yīng)有作為生物偶聯(lián)的潛力，并成功將其轉(zhuǎn)化為所謂的施陶丁格連接(Staudinger ligation)。多年來，一些生物合成技術(shù)比如共價鍵連接的熒光探針技術(shù)、親和標記技術(shù)，以及不同的(生物)分子同位素標記技術(shù)得到了實質(zhì)的發(fā)展。通過使用不同的偶合方法，已經(jīng)實現(xiàn)了在生理條件下的各種生物分子(如蛋白質(zhì)、聚糖和DNA)的修飾、細胞表面標記和蛋白質(zhì)的固定化修飾。一般情況下，建立在體外的生物偶聯(lián)策略，如硫醇馬來酰亞胺的酯偶合反應(yīng)被應(yīng)用于構(gòu)建所需的生物化合物。但在體內(nèi)環(huán)境中，大量多種類的競爭性親核物質(zhì)和親電物質(zhì)存在于蛋白質(zhì)、聚糖和成千上萬的小的有機代謝產(chǎn)物上。它們在復雜的生物系統(tǒng)中阻礙著這種技術(shù)的應(yīng)用。近幾年來，為了克服一些特異性位點技術(shù)、生物正交技術(shù)和偶聯(lián)技術(shù)在體內(nèi)標記中所遇到的問題［1］，施陶丁格連接等生物偶聯(lián)技術(shù)得到了快速的發(fā)展［2－3］。在機體環(huán)境中，特異性位點的結(jié)合需要獨特的活性官能團，但體內(nèi)并不存在這些所需的官能團。雖然這些獨特的生物正交反應(yīng)介導所需的官能團非機體本身所攜帶，但它能在生物系統(tǒng)中通過高度選擇性反應(yīng)和修飾得到［4］。最常采用的介導物質(zhì)是用于生物正交共軛技術(shù)中的疊氮化合物［5］。疊氮化合物在生物系統(tǒng)內(nèi)極為罕見，且其化學惰性決定了它在生理條件下的高度穩(wěn)定性。理所當然的是，疊氮化合物已被用于一些生物偶聯(lián)策略，包括施陶丁格連接［6］、亞銅催化的疊氮和炔烴的環(huán)加成(CuAAC)反應(yīng)［7－8］，以及近幾年出現(xiàn)的各種催化環(huán)加成反應(yīng)如環(huán)辛炔［9－10］和dibenzocyclooctynes［11］。雖然疊氮化物在環(huán)加成反應(yīng)中會產(chǎn)生一個穩(wěn)定的三氮唑橋(見圖1)，但在施陶丁格連接中疊氮化物和膦試劑的反應(yīng)會生成穩(wěn)定的酰胺鍵。Saxon和Bertozzi［6］發(fā)現(xiàn)了施陶丁格反應(yīng)在化學選擇上的潛力，就是在糖生物學中利用施陶丁格連接參與生物正交反應(yīng)。他們展示了疊氮物的可修飾性，即在含聚糖的細胞表面使用熒光膦試劑進行有效標記。

Saxon和Bertozzi教授在生物標記方法中使用施陶丁格反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)其具有溫和性和高度選擇性，這也為其在眾多化學和生物學技術(shù)上的應(yīng)用鋪平了道路。這種生物正交方式的反應(yīng)被稱作施陶丁格連接。

圖1 幾種不同的物質(zhì)與疊氮化物之間的反應(yīng)

1 施陶丁格連接的發(fā)展

1.1 施陶丁格反應(yīng)

1919 年，Staudinger和Meyer發(fā)現(xiàn)了疊氮化物和三苯基膦之間的反應(yīng)。其中，經(jīng)疊氮化物中氮原子的損失形成了膦亞胺中間體［12］。此中間體在水的存在下發(fā)生水解，生成伯胺和三苯基膦氧化物(TPPO)，如圖2所示。

圖2 膦和疊氮化物參與的經(jīng)典施陶丁格反應(yīng)

施陶丁格經(jīng)典反應(yīng)的機制已經(jīng)通過各種實驗和計算方法得以徹底了解［13－14］。其中，第1步反應(yīng)是反應(yīng)物(6)中的磷原子對疊氮化物(5)的基團進行親核攻擊，形成中間體I疊氮膦(見圖3)。在隨后的步驟中，疊氮膦進行分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)，形成一個四元環(huán)的過渡態(tài)(即中間結(jié)構(gòu)Ⅱ)，隨著氮原子的損失，產(chǎn)生了膦亞胺Ⅲa和Ⅲb的共振結(jié)構(gòu)。

圖3 施陶丁格反應(yīng)機制

反應(yīng)中，在水的存在下，膦亞胺Ⅲ將被水解生成胺(7)和穩(wěn)定的氧化膦(圖3中途徑A)。該反應(yīng)被稱為施陶丁格還原，且經(jīng)常被使用在需要引入胺類的有機合成反應(yīng)中。此外，膦亞胺中高度親核的氮原子很容易與各種親電化合物反應(yīng)，得到各種有價值的中間體。例如，Staudinger和Hauser［15］首次觀察到的氮雜－Wittig反應(yīng)，這是一個產(chǎn)生亞胺的亞氨基正膦反應(yīng)(圖3中途徑B)。該反應(yīng)與Wittig反應(yīng)表現(xiàn)出了高度的相似性，使膦亞胺與醛、酮或硫酮(8)反應(yīng)，以形成亞胺產(chǎn)物(9)。該反應(yīng)最重要的應(yīng)用就是發(fā)現(xiàn)了無環(huán)化合物和雜環(huán)化合物的合成。此外，用異(硫)氰酸酯類化合物(10)處理后的膦亞胺還可被用在碳化二亞胺的合成當中(11)，如圖3中的途徑C所示［16］。

1.2 非無痕施陶丁格連接

施陶丁格反應(yīng)現(xiàn)被稱為施陶丁格連接，專門用來研究細胞表面代謝工程。在以前的研究中，Mahal教授［17］介紹了細胞表面工程的化學選擇性連接反應(yīng)是利用酮和氨氧基或酰肼基團之間的反應(yīng)。但為了達到必要的選擇性生物正交連接的標準，就需要對施陶丁格反應(yīng)進行改進。在膦和疊氮化物的反應(yīng)中，為了使反應(yīng)平穩(wěn)地進行，需要對水和室溫進行定量。最重要的是，2種反應(yīng)物都需是非生物的正交介導物。但該反應(yīng)產(chǎn)物——氮雜葉立德會經(jīng)過快速的自發(fā)水解反應(yīng)生成伯胺和相應(yīng)的氧化膦。為了避免水解反應(yīng)的發(fā)生，就需要對膦試劑進行設(shè)計，即利用分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)帶入一個分子內(nèi)的親電陷阱去捕獲親核的氮雜葉立德中間體(見圖4)，經(jīng)過此環(huán)化步驟后產(chǎn)生一個穩(wěn)定的酰胺鍵(i.e.16)。在一個基于31P NMR的初步機理研究中提出:施陶丁格連接反應(yīng)是經(jīng)由氧膦烷中間體(17)而繼續(xù)進行的(圖4)［18］。然而，最近有報道對該反應(yīng)的不同機制進行了探索，分析了中間體結(jié)構(gòu)(14)中所涉及的關(guān)鍵步驟(基于1H NMR，2D1H和13C NMR光譜，以及X－射線結(jié)晶)，得出的結(jié)論是氧化膦中的氧原子來自于水分子［19］。

圖4 施陶丁格連接機制

1.3 無痕施陶丁格連接

在非無痕施陶丁格連接公布后不久，Raines等［20］和Bertozzi等［23］同時報道了所謂的無痕施陶丁格連接。該變型與非無痕施陶丁格連接的區(qū)別是:在最終的水解步驟中，產(chǎn)物消除了氧化膦。Raines等［22］通過研究證明:需要共軛的2個肽片段可通過無痕施陶丁格連接代替原有的化學連接方法。在他們的研究中，2－(二苯基膦)－苯硫醇(19)和(二苯基膦)甲硫醇(20)分別作為該連接的硫酯和疊氮化物的輔助反應(yīng)物［20，22］。在該反應(yīng)的第一步中，硫酯(18)在膦硫醇(19或20)的條件下進行轉(zhuǎn)硫酯化;然后被激活的硫酯(21)與疊氮化物(22)反應(yīng)形成膦亞胺(23);后經(jīng)分子內(nèi)重排形成氨基磷酸鹽(24)，經(jīng)水解得到酰胺(25)(圖5)。此外，試劑(20)在反應(yīng)中的高速率和高度化學選擇性，使之成為介導施陶丁格連接最有效的偶合試劑。

圖5 以硫醇為反應(yīng)輔助物的無痕施陶丁格連接

由Saxon等［21］描述的無痕施陶丁格連接方法在實施過程中可設(shè)計不同的膦?；衔?，通過不同的聯(lián)動系統(tǒng)進行切割以形成酰胺鍵，如圖6 (a)所示。在這些化合物的反應(yīng)中，決定一個結(jié)構(gòu)性的先決條件是需要在2個芳香膦取代基的存在下進行反應(yīng)，以防止膦的過度氧化。在一個模型反應(yīng)中，把4種?；⒃噭?26a～d)用疊氮核苷(27)進行處理后，化合物26a和26b都得到了較高收率的施陶丁格連接產(chǎn)物，而化合物26c和26d只得到了氮雜內(nèi)鎓鹽水解產(chǎn)物，如圖6(b)所示。

圖6 無痕施陶丁格連接方法

2 施陶丁格連接在生物標記中的應(yīng)用

在化學生物學中，用于研究生物系統(tǒng)最重要的方法之一就是把小分子結(jié)合到生物分子上。而施陶丁格連接就是一種有效的偶合策略，已被廣泛應(yīng)用于生物分子中化學探針的偶合。在生物分子內(nèi)使用施陶丁格連接作為生物偶聯(lián)的方法需要在膦或疊氮化物的存在下進行反應(yīng)，而疊氮化物的分子大小和在生理條件下的穩(wěn)定性使其可作為反應(yīng)物的首要選擇。另外，部分疊氮基可以很容易地通過化學方法(如重氮基轉(zhuǎn)移)或者生物合成的基本途徑結(jié)合于糖鏈、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA上。以下主要是對施陶丁格連接在不同的生物分子中作為標記試劑的方法進行討論。

2.1 聚糖標記

分子成像技術(shù)使機體環(huán)境中的生物分子可視化且避免了大量的干擾。聚糖的體內(nèi)成像觀察是非常有趣的，因為這些生物聚合物參與了許多的生物變化過程，包括細胞間的相互作用、分子轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導和內(nèi)吞作用［23－24］?，F(xiàn)有的分子生物學技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)和DNA的分析和成像技術(shù)，但還不能應(yīng)用于研究聚糖，因為聚糖在基因組中不直接參與編碼。雖然聚糖可通過外源凝集素和抗體的作用成像，但在體內(nèi)使用這些檢測方法受到了其低親和力特性的限制［25］。用于聚糖成像的另一種方法就是利用席夫堿與醛或酮所形成的結(jié)構(gòu)。但這個方法也會產(chǎn)生問題，即聚糖會非特異性地結(jié)合于體內(nèi)的內(nèi)源性代謝物［4，17］。在聚糖成像領(lǐng)域取得突破的是Saxon和Bertozzi［6］。他們利用修飾后的疊氮化甘露糖的衍生物，即N－疊氮乙酰甘露糖胺(30)作為生物正交介導物來實現(xiàn)聚糖成像。Jurkat細胞與單糖(30)的培養(yǎng)導致該化合物通過唾液酸的生物合成途徑(圖7)引入聚糖［26］。引入的ManNAz單元隨后被可視化為膦－生物素探針(38，圖9)進行施陶丁格連接。在生物素標記的糖鏈被用熒光標記的抗生素蛋白處理后，該復合體就能在熒光下被觀測到。

圖7 通過生物合成方式將疊氮化糖類引入糖綴合中的反應(yīng)機理

另外，像大分子的類似物如N－乙酰甘露糖胺等都不能或只能極少地整合。事實證明，在生物合成過程中，整合的過程受阻于由ManNAc 6－激酶所產(chǎn)生ManNAc衍生物的較差轉(zhuǎn)化［27］。為了克服這個特定的酶促步驟，對其引入了唾液酸的衍生物(32)，它能有效地被傳遞到細胞表面［28］。在隨后的研究中，Bertozzi等對小鼠的脾細胞進行了施陶丁格連接實驗。他們對小鼠注射糖(30)后產(chǎn)生了被疊氮化物標記的脾細胞。具體步驟就是在第二步中(不包括體外)用FLAG化合物(37)進行施陶丁格連接(圖9)，然后經(jīng)流式細胞儀進行分析檢測［29］。在監(jiān)測細胞表面標記或用于蛋白質(zhì)組的分析中，雖然FLAG－膦綴合物(37)和生物素－膦綴合物(38)均可作為合適的探針，但其不適用于聚糖的體內(nèi)成像。在生命系統(tǒng)中，有熒光標記功能的膦探針被應(yīng)用于對聚糖的可視化觀察。綴合物Cy5－膦(39)在熒光素－膦(40)和羅丹明－膦(41)中，由于其低熒光背景的顯示特征被證明是優(yōu)良的膦探針熒光標記物。綴合物Cy5－膦(39)的低熒光背景效應(yīng)歸因于其較高的電荷密度，因此具有較大的溶解度，能更有效地去除過量的膦綴合物［30］。

圖8 疊氮官能類似物引入自然單糖的生物合成途徑

此外，通過對聚糖使用疊氮糖代謝標記和膦修飾的熒光成像探針的可視化觀察，Bertozzi等［31］應(yīng)用熒光素－膦綴合物(42)的生物發(fā)光對細胞表面的聚糖進行檢測，并對該熒光素－膦綴合物與含疊氮基的聚糖進行施陶丁格連接，游離的熒光素擴散到由熒光素酶轉(zhuǎn)化為能產(chǎn)生生物光的氧化熒光素的細胞中。

圖9 各種三芳基膦的結(jié)合物分子結(jié)構(gòu)

2.2 蛋白質(zhì)標記

用于蛋白質(zhì)標記的施陶丁格連接的一個關(guān)鍵要求是特定的蛋白質(zhì)能與膦或疊氮化物標記功能化。該反應(yīng)優(yōu)先選擇疊氮化物，因為在水溶液中的膦部分在化學處理過程中氧化程度較高;而疊氮化物則可以通過化學方法引入到蛋白質(zhì)中，也就是通過重氮基轉(zhuǎn)移反應(yīng)或生物化學反應(yīng)［32］，以及通過使用基因工程為蛋白質(zhì)引入含疊氮基的氨基酸或通過翻譯進行修飾［33－34］。

2.2.1 非天然氨基酸標記

通過細胞翻譯機制，可以利用體外(即在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞)任意一個位點特異性或殘基位置特異性來實現(xiàn)氨基酸類似物的引入。這種引入是受到氨?；璽RNA合成酶(aaRS)最嚴格的控制。這些酶負責氨基酸到tRNA的偶合。例如，蛋氨酸的結(jié)構(gòu)類似物(見圖10)可以通過甲硫氨酰－tRNA合成酶(MetRS)以殘基位置特異性的方式引入到蛋白質(zhì)中。

圖10 蛋氨酸類似物通過MetRS引入蛋白質(zhì)中的反應(yīng)機理

2.2.2 蛋白修飾酶標記

利用施陶丁格連接進行蛋白質(zhì)位點選擇性標記的另一種方法是在使用蛋白質(zhì)修飾酶的基礎(chǔ)上進行翻譯后修飾。含疊氮化物的標記通過能識別一個特定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)修飾酶共價偶聯(lián)于靶蛋白上。Ting等［35］利用從古細菌P.horikoshii提取出的生物素連接酶去位點選擇性地將疊氮化生物素類似物(46)和內(nèi)源性生物素蛋白質(zhì)進行連接(eBAP)。在疊氮化生物素類似物與蛋白進行酶促偶聯(lián)后，利用施陶丁格連接形成三芳基膦－FLAG綴合物(37，見圖11)，最后所得的產(chǎn)物用anti－FLAG抗體進行免疫印跡檢測。

圖11 翻譯后修飾的eBAP被FLAG－膦(37)標記并帶有疊氮化生物素類似物(46)的反應(yīng)機理

3 結(jié)束語

目前，生物正交偶合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)生物學中，并且在化學中的影響正迅速擴大。此外，新的偶合策略允許對以前不能用現(xiàn)有技術(shù)研究的復雜生物目標進行修改。施陶丁格連接目前在原生環(huán)境中已被證明特別適用于生物分子的標記。除了可作為有效的標識試劑外，施陶丁格連接已經(jīng)被證明是一個能在多肽類、糖肽類和糖蛋白的表面結(jié)構(gòu)進行精確修飾的方法。但是，所有的生物正交反應(yīng)都是通過引入非天然的介導物對生物分子進行修改，雖然對于機體本身來說是極小的變化，但機體的原生環(huán)境可能會影響生物分子的結(jié)構(gòu)、活性和穩(wěn)定性。因此，尋求一種不依賴疊氮基作為介導的生物正交技術(shù)仍然是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)。

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(責任編輯 何杰玲)

Application of the Staudinger Ligation in Bio-labeling

XU Fan1，GAO Yan－long1，WU Chao－zhu1，JIANG He1，2
(1.School of Pharmacy and Bioengineering，
Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China; 2.Chongqing Frontier Biotechnologies Co.，Chongqing 400041，China)

In bio－orthogonal reaction，the azide and the phosphine functions has resulted in the Staudinger ligation playing an important role in a variety of complex biological systems.For instance，the Staudinger ligation has been used for labeling glycans，lipids，DNA，and proteins.Moreover，the Staudinger ligation method is used to construct glycopeptides，microarrays，and functional biopolymers.In the emerging field of bio－orthogonal，the Staudinger ligation has set a high standard to which most of the new techniques are often compared.This review summarizes recent developments of the Staudinger ligation and its application trends in the field of biological labeling.

Staudinger ligation;the azide;bio－orthogonal reaction;bio－labeling

O643

A

1674－8425(2014)05－0067－07

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.014

2013－10－27

重慶市科技攻關(guān)項目(Cstc2011ggC10003－29)

徐凡(1987—)，男，重慶人，碩士研究生，主要從事新藥研發(fā)與多肽合成研究。

徐凡，郜炎龍，吳超柱，等.施陶丁格連接在生物標記中的應(yīng)用［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014 (5):67－73.

format:XU Fan，GAO Yan－long，WU Chao－zhu，et al.Application of the Staudinger Ligation in Bio－labeling［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(5):67－73.