抑瘤素M在大鼠非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展中的作用

彭菊聰，萇新明，張玲娟，劉毓屾，秦 潔

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種與胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和遺傳易感性密切相關(guān)，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高及生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率不斷攀升，已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家第一大慢性肝病及健康人血清肝酶升高的首要原因[2]，在我國(guó)也僅次于慢性病毒性肝炎而位居第二，在某些地區(qū)甚至超過(guò)了病毒性肝炎的發(fā)病率。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛深入的研究，但至今仍然未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，抑瘤素M(oncostatin M, OSM)可促進(jìn)IL-6和TNF-α表達(dá)[3-4]，能抑制脂聯(lián)素(adiponectin, ADP)的產(chǎn)生[5]，還能介導(dǎo)IR形成[6]。IR、IL-6、TNF-α、ADP又與NAFLD發(fā)病密切相關(guān)，但有關(guān)OSM及受體(OSM receptor, OSMR)與NAFLD關(guān)系的研究報(bào)道甚少。因此，研究OSM與OSMR在NAFLD中的表達(dá)變化，有助于進(jìn)一步了解NAFLD可能的發(fā)病機(jī)制，并為診斷治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠30只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(140±20)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要原料及試劑膽固醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，膽酸鈉(北京奧博星生物有限責(zé)任公司)。大鼠OSM ELISA試劑盒(96人份，美國(guó)RD Biosciences公司)。兔抗大鼠OSM和OSMR多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3NAFLD模型的建立及取材30只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，各組15只。對(duì)照組給予普通飼料，模型組飼予高脂飲食(配方組份比例為：82.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料+2%膽固醇+10%豬油+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉[7])。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由飲水進(jìn)食和活動(dòng)，分籠飼養(yǎng)在本校動(dòng)物中心普通動(dòng)物房，共飼養(yǎng)12周。

12周末隔夜禁食后處死所有大鼠，處死前稱體質(zhì)量。以100 g/L水合氯醛(0.3～0.5 mL/100 g)麻醉，腹主動(dòng)脈取血5～6 mL，以備血清OSM、胰島素及其他生化指標(biāo)的檢測(cè)。取血后迅速摘取完整肝臟，稱肝濕重并計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。取每只大鼠肝右葉相同部位1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小的兩塊肝組織，一部分立即行冰凍切片，另一部分用40 g/L多聚甲醛固定。

1.4血清生化指標(biāo)的測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)和空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)。用放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(fasting serum insulin, FINS)水平，用HOMA-IR方法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)，IRI=(FPG×FINS)/22.5。ELISA雙抗夾心法檢測(cè)血清OSM含量。

1.5肝組織病理學(xué)檢查肝組織冰凍切片行油紅O染色，石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化。NAFLD活動(dòng)度積分標(biāo)準(zhǔn)參照2010年版《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[1]。

1.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用Max VisionTM二步法染色肝組織OSM和OSMR，具體操作步驟按MaxVisionTM試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。5 μm厚組織切片經(jīng)檸檬酸緩沖液微波修復(fù)抗原；30 mL/L H2O2孵育滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；兔抗大鼠多克隆抗體(OSM按1∶100稀釋，OSMR按1∶150稀釋)孵育后滴加MaxVisionTM試劑，顯色、封片。

免疫組化結(jié)果判定：由2位病理醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估結(jié)果。每張切片均隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的高倍視野(×400)。綜合陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分；陽(yáng)性細(xì)胞<10%，1分；10%～50%，2分；>50%，3分。染色強(qiáng)弱計(jì)分：不著色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。兩項(xiàng)得分相加為免疫組化評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1大鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)的變化大鼠體質(zhì)量隨著造模吋間延長(zhǎng)不斷增加，12周末模型組大鼠體質(zhì)量高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.438)。模型組肝濕重、肝指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01，表1)。

表1兩組大鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)的比較

與對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.2大鼠肝功、血脂的變化模型組血清ALT、AST和CHOL較正常對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組血清TG較正常對(duì)照組升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.3大鼠血清OSM、FINS和IRI的變化與對(duì)照組相比，模型組血清OSM、FINS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)PG及IRI顯著升高(P<0.01，表2)。

表2兩組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

2.4肝臟大體及病理學(xué)改變對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑，邊緣銳利，顏色紅潤(rùn)有光澤。HE染色見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞基本無(wú)脂肪變性，油紅O染色見(jiàn)少量體積較小的紅色脂滴。模型組大鼠肝臟體積顯著增大，邊緣鈍圓，顏色呈土黃色，切面油膩感。HE染色見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝竇間隙明顯變窄，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的圓形空泡，嚴(yán)重者細(xì)胞核被脂滴擠向一側(cè)，小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見(jiàn)局灶性壞死、碎屑樣壞死和點(diǎn)片狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。油紅O染色見(jiàn)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿了鮮紅色脂滴。模型組肝組織脂肪變性、炎癥及氣球樣變程度較對(duì)照組嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組肝組織NAFLD活動(dòng)度積分都在5分以上，平均積分大于4分，因此模型組大鼠均達(dá)NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照組大鼠NAFLD活動(dòng)度積分均小于3分，為正常肝組織(圖1、表3)。

圖1兩組大鼠肝臟病理學(xué)變化

Fig.1 Hepatic histopathological changes between two group rats

A、C：對(duì)照組；B、D：模型組。A、B：HE，×400；C、D：油紅O染色，×200。

表3大鼠肝組織NAFLD活動(dòng)度積分的比較

Tab.3 Comparison of NAFLD activity scores between the two groups (n=15)

與對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.5肝臟OSM和OSMR的表達(dá)結(jié)果OSM主要表達(dá)于浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，枯否細(xì)胞(Kupffer cells, KC)及肝細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)也見(jiàn)少量表達(dá)。模型組OSM表達(dá)評(píng)分(3.93±1.09)顯著高于對(duì)照組(2.80±0.77)(P<0.01，圖2)。OSMR主要表達(dá)在肝細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜，尤其是中央靜脈周圍的肝細(xì)胞。對(duì)照組OSMR表達(dá)評(píng)分(2.33±1.04)低于模型組(4.0±1.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

3 討 論

NAFLD是一種慢性低度炎癥和IR狀態(tài)，IR是NAFLD的重要特征。1998年DAY等[8]所提出了NAFLD發(fā)病機(jī)制的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為IR是NAFLD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，已被廣泛認(rèn)可。研究還表明，IR還是NAFLD發(fā)病的始動(dòng)因素而非結(jié)果，貫穿于發(fā)病機(jī)制全過(guò)程[9]。SAKURAI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IR與肝臟脂肪變性的相關(guān)性較體脂指數(shù)高，幾乎所有的NAFLD患者存在肝臟和周圍組織的IR，而不一定存在肥胖及糖脂代謝紊亂。這都說(shuō)明IR是NAFLD的一個(gè)極其重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MFPG較對(duì)照組顯著升高，F(xiàn)INS和IRI也較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明模型組大鼠胰島素敏感性下降，存在IR、高胰島素血癥狀態(tài)，這與既往研究結(jié)果一致。

圖2OSM在各組肝臟組織中的表達(dá)

Fig.2 The positive expression of OSM in the liver tissue of each group (×400)

A、B：對(duì)照組；C、D：模型組。

圖3OSMR在各組肝臟中的表達(dá)

Fig.3 The positive expression of OSMR in the liver tissue of each group (×400)

A：模型組；B：對(duì)照組。

OSM是一種能耐酸、耐熱的分泌型單鏈糖蛋白。最初是ZARLING等[11]于1986年從佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸酯((phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)培育的淋巴瘤細(xì)胞U937細(xì)胞上清分離提純獲得，因具有抑制A351黑色素瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)作用而得名。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)OSM還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4,12-13]。OSM由單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化的T細(xì)胞等分泌[14-15]。肝臟中的KC也可分泌OSM[6]。OSM有兩種類型受體，Ⅰ型OSMR和Ⅱ型OSMR，Ⅱ型為OSM的特異性受體。鼠OSM也有兩種受體，但只與Ⅱ型OSMR結(jié)合，不與Ⅰ型OSMR結(jié)合。

本研究結(jié)果顯示，OSM在對(duì)照組大鼠血清和肝組織低表達(dá)，而在模型組表達(dá)顯著增高，這與HENKEL等[6]在小鼠NAFLD模型中的研究結(jié)果一致。HENKEL還發(fā)現(xiàn)OSM的升高早于IL-6，升高水平也較IL-6顯著，在肝臟未出現(xiàn)明顯炎癥前即有明顯升高。因此推測(cè)OSM升高是NAFLD發(fā)病的早期事件而非結(jié)果。此外，OSM可誘導(dǎo)星形細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-6，OSM促進(jìn)IL-6的分泌呈時(shí)間和劑量依賴性；BAKER等[3]研究發(fā)現(xiàn)，OSM可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)途徑誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)。IL-6和TNF-α可促進(jìn)脂肪分解、炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)IR形成，為NAFLD重要致病因子，與NAFLD的嚴(yán)重程度正相關(guān)。SONG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，OSM可抑制脂肪細(xì)胞ADP mRNA表達(dá)和蛋白的分泌，ADP可增強(qiáng)胰島素的敏感性、減輕肝臟脂肪沉積和抗炎抗肝纖維化作用，是NAFLD的重要保護(hù)因素。還有研究發(fā)現(xiàn)，OSM可增加肝細(xì)胞細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling3, SOCS3)mRNA表達(dá)，增高的SOCS3又可阻礙胰島素受體底物IRS-1和IRS-1的酪氨酸磷酸化，干擾胰島素信號(hào)通路，介導(dǎo)IR[6,16]。此外，OSM也可直接抑制胰島素依賴的Akt激酶的磷酸化和調(diào)節(jié)葡萄糖降解和糖原合成的葡萄糖激酶的活性，使葡萄糖利用發(fā)生障礙，導(dǎo)致IR。這提示OSM促進(jìn)了NAFLD的進(jìn)展。OSM主要表達(dá)于浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，KC和肝細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)也見(jiàn)少量表達(dá)。這與既往研究所發(fā)現(xiàn)的OSM可由多種細(xì)胞分泌，OSM廣泛表達(dá)于炎癥反應(yīng)和損傷組織修復(fù)部位結(jié)果基本一致[14-15,17]。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)OSMR與NAFLD發(fā)病關(guān)系的研究報(bào)道。由于大鼠雖有兩種OSMR，但研究發(fā)現(xiàn)只與特異性的Ⅱ型受體結(jié)合，因此本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了OSM的特異性受體。OSMR在模型組肝組織表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OSMR主要在肝細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜表達(dá)，尤其是中央靜脈周圍的肝細(xì)胞。這與NOYKO等[18]在肝硬化患者中檢測(cè)到OSMR的表達(dá)部位一致。NAKAMURA等[19]研究發(fā)現(xiàn)，OSMR在正常小鼠肝組織基本不表達(dá)，而給以CCL4誘導(dǎo)肝臟損傷后OSMR表達(dá)增高，認(rèn)為OSMR參與了組織損傷反應(yīng)。

綜上所述，循環(huán)血中OSM和肝組織中OSM、OSMR表達(dá)升高參與了NAFLD發(fā)病，OSM可能是NAFLD發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因子。但是OSM及OSMR表達(dá)升高的原因及在NAFLD發(fā)病網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中的確切作用有待進(jìn)一步研究。

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