缺氧誘導的腫瘤特異性基因治療載體的靶向性鑒定

賀 賽，鄭見寶，孫學軍，陳南征，周培華，賈蓬勃， 魏光兵，王 暉，姚建鋒，祿韶英

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安 710061)

設計具有靶向性和安全性的基因轉運系統(tǒng)，尋找腫瘤特異性轉錄調控元件，從而使外源基因能夠持續(xù)、穩(wěn)定和特異表達是目前腫瘤基因治療的主要研究方向之一[1-3]。腫瘤特異性hTERT啟動子能在轉錄水平上驅動下游基因的表達，高效、選擇性地在腫瘤組織中激活其后的外源基因的轉錄，從而實現治療基因在腫瘤中的選擇性表達，避免損傷周圍正常組織[4-5]。為了進一步提高該啟動子在腫瘤組織中的表達特異性并增強其活性，根據實體瘤組織局部的缺氧微環(huán)境特點以及缺氧反應元件(HRE)可使異源啟動子在缺氧微環(huán)境下激活的特性[6-8]，本課題組前期構建完成了5個拷貝的HRE和hTERTp雙靶向聯合調控元件，調控抑癌基因CDX2表達的慢病毒表達載體(5HhC)，并完成病毒包裝及滴度測定。本研究利用5HhC病毒感染hTERT+LoVo細胞及hTERT-HK-2細胞,并在缺氧和常氧環(huán)境下檢測5HhC/LoVo細胞中CDX2的表達，研究缺氧環(huán)境對治療載體5HhC表達的調控作用，為利用缺氧微環(huán)境強化腫瘤的靶向性基因治療提供實驗依據，并為下一步的細胞實驗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料實驗組細胞hTERT+人結腸癌細胞株LoVo、對照組細胞hTERT-人腎小管上皮細胞株HK-2以及慢病毒表達載體5HhC病毒液均由本課題組前期保存。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。逆轉錄試劑盒及PCR所用試劑和酶均購自TaKaRa公司。DNA marker系廣州東盛科技有限公司產品。二氯化鈷(CoCl2，相對分子質量237 930)、瓊脂糖和四唑氮藍(MTT)購自Sigma公司，哺乳動物細胞蛋白裂解液(RIPA)及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉生物科技有限公司。CDX2 多克隆抗體購自Epitomics公司，RNA提取試劑盒是Promega公司產品。

1.2MTT法檢測CoCl2對結腸癌細胞株LoVo生長增殖的影響取對數生長期的LoVo細胞以2 000個/孔接種4塊96孔板，培養(yǎng)過夜。每塊96孔板均加入不同濃度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2溶液，各濃度設置5個副孔，作用1、3、5、7 d后分別終止反應，每孔加入50 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸棄上清液，每孔內加入150 μL二甲亞砜(DMSO)，振蕩15 min溶解沉淀，酶標儀在490 nm下讀取吸光度A值。上述實驗重復3次，繪制細胞在不同濃度CoCl2作用下的生長曲線，不加CoCl2的腫瘤細胞作為空白對照。

1.3免疫細胞化學法檢測慢病毒載體5HhC表達將清潔、滅菌處理的蓋玻片鋪于24孔板底部，將處于對數期生長的hTERT+LoVo細胞及hTERT-HK-2細胞(3×104/mL)接種于板內，待細胞長成單層后，根據之前本課題組檢測的病毒滴度(1×108TU/mL)及感染效率，用5HhC慢病毒液5 μL/孔感染LoVo與HK-2細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出蓋玻片，用0.01 mol/L PBS沖洗2遍，再以40 g/L多聚甲醛固定30 min，TritonX-100固定20 min，使用FLAG兔抗人一抗(1∶100，Sigma)4 ℃孵育過夜，加入1∶500生物素化羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，然后滴加SABC試劑37 ℃孵育20 min，最后用DAB顯色，光鏡下觀察。

1.4Westernblot檢測缺氧微環(huán)境調控下細胞內CDX2蛋白的表達水平復蘇前期篩選的穩(wěn)定表達5HhC的LoVo細胞(5HhC/LoVo)，傳代后隨機分為缺氧組和常氧組，缺氧組用不同濃度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2溶液模擬缺氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，常氧組及正常LoVo細胞在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。用上述實驗獲得的CoCl2有效濃度作用5HhC/LoVo細胞12、24、36 h，常氧組作為對照。RIPA裂解法提取上述細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，與5×SDS凝膠加樣緩沖液混合，100 ℃ 5 min變性蛋白，100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉PVDF膜20V，40 min，以含50 g/L脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，加CDX2一抗(1∶2 000)，β-actin一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜；二抗(1∶3 000)室溫1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。各組實驗重復3次。

1.5RT-PCR檢測缺氧微環(huán)境調控下細胞內CDX2mRNA的表達水平實驗分組同1.4，缺氧組加入CoCl2溶液(使用濃度依據步驟1.4結果)培養(yǎng)24 h。用Trizol按說明書要求提取細胞RNA，并逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參照，根據Genbank中CDX2基因片段序列(NM_001265)設計如下引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用PCR方法擴增CDX2。其上游引物：5′-CCGCTCGAGATGTACG-TGAGCTACCTCCTGGACAAGGAC-3′，下游引物：5′-GGGGTACCGTCTGGGTGACGGTGGGG-TTTAGCACCCCCCCAGTTG-3′，擴增片段943 bp；β-actin上游引物：5′-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物：5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′，預計擴增片段長度170 bp。反應條件均為25 μL的反應體系，95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，最后至4 ℃終止。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。各組實驗重復3次。

2 結 果

2.1CoCl2劑量依賴性抑制LoVo細胞的增殖MTT法檢測結果顯示CoCl2濃度在100～200 μmol/L時，其對LoVo細胞增殖活力的抑制并不明顯；當濃度在300～500 μmol/L范圍內時，LoVo細胞的增殖活力受到抑制，且在第5天后更加明顯(P<0.05，圖1)。

圖1不同濃度CoCl2對結腸癌細胞LoVo增殖活力的影響

Fig.1 Effects of different concentrations of CoCl2on proliferation of LoVo cells

2.2重組慢病毒5HhC感染hTERT+LoVo細胞及hTERT-HK-2細胞重組慢病毒5HhC感染hTERT+LoVo細胞及hTERT-HK-2細胞48 h后，免疫細胞化學檢測LoVo細胞和HK-2細胞中FLAG的表達，鏡下可見LoVo胞質內有棕黃色的FLAG染色顆粒，而HK-2細胞質內無棕黃色顆粒(圖2)。由此說明，hTERTp啟動子能夠調控治療載體5HhC僅在hTERT陽性細胞中表達，而在hTERT陰性細胞中不表達。

2.3缺氧上調5HhC/LoVo細胞內CDX2蛋白的表達Western blot結果(圖3)顯示：5HhC/LoVo細胞內CDX2蛋白表達量高于LoVo細胞，且在缺氧環(huán)境中更加明顯。不同濃度CoCl2(100、200、300、400、500 μmol/L)作用24 h均可上調5HhC/LoVo細胞內CDX2表達量，而在300 μmol/L，24 h時表達量最高，200 μmol/L，24 h時次之，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。5HhC/LoVo細胞內CDX2表達量在300 μmol/L CoCl2作用12、24、36 h后，均明顯高于常氧組，且在作用24 h后表達量達到最大(圖4)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，缺氧微環(huán)境可以明顯上調5HhC/LoVo細胞內CDX2蛋白的表達，且在300 μmol/L CoCl2，作用24 h其上調最明顯。

圖2免疫組化法檢測hTERT+LoVo和hTERT-HK-2細胞中FLAG的表達

Fig.2 Expression of FLAG in hTERT+LoVo and hTERT-HK-2 cells detected by immunohistochemistry (×200)

A：重組慢病毒5HhC感染的LoVo細胞；B：重組慢病毒5HhC感染的HK-2細胞；C：LoVo細胞；D：HK-2細胞。

圖3不同濃度CoCl2模擬缺氧微環(huán)境下5HhC/LoVo細胞內CDX2蛋白表達

Fig.3 The CDX2 protein expression in 5HhC/LoVo cells under different concentrations of CoCl2

圖4CoCl2(300μmol/L)作用不同時間后5HhC/LoVo細胞內CDX2蛋白表達

Fig.4 The CDX2 protein expression in 5HhC/LoVo cells for different time periods with the 300 μmol/L CoCl2

2.4缺氧上調5HhC/LoVo細胞內CDX2mRNA的表達RT-PCR結果(圖5)顯示：5HhC/LoVo細胞內CDX2 mRNA表達量高于LoVo細胞，且在200 μmol/LCoCl2作用24 h后更加明顯(P<0.05)。瓊脂糖電泳顯示為943 bp大小的特異性條帶。以上顯示，缺氧微環(huán)境通過對5HRE增強子的作用明顯上調CDX2基因的表達水平。

圖5缺氧微環(huán)境對5HhC/LoVo細胞內CDX2mRNA表達的影響

Fig.5 Effect of hypoxia microenvironment on the expression of CDX2 mRNA in 5HhC/LoVo cells

M：1 kb marker；N：DL2000 marker；1：LoVo細胞；2：5HhC/LoVo細胞；3：5HhC/LoVo細胞(CoCl2200 μmol/L 24 h)。

3 討 論

低氧是實體腫瘤的共同特征，它是癌細胞快速增殖與血液供應相對滯后的結果[9]。近年來微環(huán)境低氧與腫瘤的關系倍受關注，低氧通過調控多種基因表達而影響腫瘤細胞的生物學特性，缺氧因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)作為缺氧誘導下最重要的轉錄因子，參與調控一系列缺氧誘導的靶基因表達[10-11]。HRE是位于低氧相關基因3′或5′端的一段DNA序列，其核心序列可與HIF-1特異結合，形成轉錄起始復合物，從而啟動靶基因的轉錄[12]。近年來，為了增加目的基因在缺氧微環(huán)境下的表達水平，5個拷貝的HRE作為一種增強子，經常被應用于治療載體的構建。SHIBATA等[13]首先構建了5HRE并研究，發(fā)現其在缺氧的微環(huán)境下可將調控的靶基因表達水平增加40～50倍。WANG等[14]證明5HRE調控的TSST-1基因的表達在缺氧微環(huán)境下能夠明顯上調。因此，作為增強子，5HRE在缺氧微環(huán)境下可以上調目的基因的表達。

分子靶向性基因治療在腫瘤治療中具有廣闊應用前景，而對于抑癌基因的應用常常因缺乏腫瘤特異性而受到限制，使用腫瘤特異性啟動子調控治療載體的表達克服了該弊端，使得抑癌基因應用于腫瘤的基因治療成為可能。hTERT啟動子由于其在大多數腫瘤細胞中表達，而在正常細胞中不表達[15-17]，使得其在治療載體的構建中成為一種有用的調控元件。ZHANG等[18]構建了一種hTERT啟動子調控的表達載體，使該載體對人肺A549腺癌細胞增殖具有特異性抑制作用，而對正常細胞無影響。有研究者構建了一種hTERT啟動子調控的溶菌細胞腺病毒載體，可以有效特異性殺傷人腫瘤細胞，而對人正常體細胞沒有作用[19]。這些表明在腫瘤的基因治療過程中，腫瘤特異性的hTERT啟動子提供了一種新途徑。

因此，本課題組前期構建了由5HRE增強子和hTERT啟動子聯合調控抑癌基因CDX2表達的慢病毒表達載體5HhC，并對其進行病毒包裝，通過免疫組化法發(fā)現hTERT啟動子在人結腸癌細胞株LoVo中為陽性表達，而在人腎小管上皮細胞株HK-2中不表達，且篩選獲得了穩(wěn)定表達5HhC的LoVo細胞(5HhC/LoVo)。本實驗通過病毒液5HhC感染hTERT+LoVo細胞及hTERT-HK-2細胞，結果發(fā)現該治療載體在LoVo細胞中表達，而在HK-2細胞中不表達，證明了其hTERT靶向性。又通過Western blot檢測，發(fā)現不同濃度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2作用24 h均可以上調5HhC/LoVo細胞內CDX2的表達，且在300 μmol/L上調最為顯著，200 μmol/L次之；在不同的時間點12、24、36 h，CoCl2濃度300 μmol/L作用24 h時，目的基因CDX2具有最高的表達量。RT-PCR檢測顯示，CDX2 mRNA的表達量在缺氧微環(huán)境下(200 μmol/L，24 h)明顯增加，與其蛋白水平結果一致。證明了該治療載體在5HRE增強子作用下，其抑癌基因CDX2在缺氧微環(huán)境下的表達量均可明顯上調。聯合MTT實驗顯示的不同濃度CoCl2對LoVo細胞的增殖能力的影響，提示200 μmol/L CoCl2濃度既可以明顯上調目的基因的表達，且具有較小的細胞毒性，為后續(xù)分子及細胞學實驗中CoCl2濃度的選擇提供了理論依據。

總之，本研究成功的對缺氧誘導的腫瘤特異性基因治療載體5HhC的hTERT靶向性及缺氧可誘導性進行了鑒定，為后續(xù)該治療載體5HhC在體內及體外的功能研究奠定了基礎。

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