CXCR7-shRNA靶向抑制結腸癌SW620細胞的體外實驗研究

王 鑫，陳 玲，孫 飛，陸 航

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院：1.急診科；2.胃腸外科，遼寧錦州 121001)

結直腸癌是目前我國最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高于世界平均水平。早期發(fā)生的侵襲轉移是影響結直腸癌患者預后及生存的主要因素，治療效果和臨床預后不是十分理想[1-2]。隨著基因治療的發(fā)展，從分子水平來阻斷侵襲轉移的基礎和環(huán)境是目前腫瘤治療研究的前沿。因此，我們需要深入地了解結直腸癌的轉移機制并尋找有效的診斷標志物和新的治療位點[3-4]。

趨化因子(chemokines)是一類最先發(fā)現表達于免疫細胞、控制其定向炎癥區(qū)域遷移的細胞因子[5]。研究顯示，趨化因子及其受體在腫瘤的增殖、轉移過程中扮演著重要的角色[6]。有研究發(fā)現，CXC趨化因子12(CXC chemokine ligand 12, CXCL12)和CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)之間的相互作用是腫瘤侵襲轉移和增殖的關鍵生物學行為。然而，最近的研究表明，在前列腺癌或乳腺癌中發(fā)現了CXCL12的另一個趨化因子受體CXCR7(CXC chemokine receptor 7, CXCR7)也可以提高腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移能力[7-8]。在前期研究中，我們發(fā)現從人結直腸癌組織中可檢測到大量的CXCR7蛋白的表達，相比于正常組織及癌旁組織有顯著的提高，由此可以推測CXCR7可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學作用。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術聯(lián)合慢病毒載體(lentiviral vector)為內源性功能基因研究和治療提供了新的策略[9-10]。本研究將構建人CXCR7的慢病毒小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)沉默表達載體，檢測轉染SW620細胞后對其增殖與轉移功能的影響，為后續(xù)研究以CXCR7/CXCL12生物學軸為靶點的腫瘤基因治療打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1實驗試劑pSilencerTM4.1慢病毒載體系統(tǒng)、Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；HEK293T細胞株、人結腸癌細胞株SW620購自中科院細胞庫；1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；限制性核酸內切酶、DNA連接酶、質粒小提試劑盒、RT-PCR一步法試劑盒、凝膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司；兔抗人CXCR7單克隆抗體、二抗、內參照等購自Santa Cruz公司；其他常規(guī)試劑由遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2引物設計與合成根據GenBank(NM_020311)顯示的人CXCR7序列設計3對shRNA沉默序列引物及1對陰性對照序列，經美國國立生物技術信息中心(NCBI)的數據庫進行序列檢索，結果其他基因序列無同源性，引物的設計與合成由TaKaRa公司完成(表1)。

表1CXCR7-shRNA引物序列

Tab.1 CXCR7-shRNA primer sequence

名 稱序列(5'～3')CXCR7-shRNA-1-FTCCCGACTTCATCTTTGCTCGACCXCR7-shRNA-1-RTCATCTTTGCTCGAGCAAAGATGCXCR7-shRNA-2-FTAGATAACTACACCGAGGAAATCCXCR7-shRNA-2-RTGCATTACTCGAGTAATGCAATAGCXCR7-shRNA-3-FTGTCCTGCTATTGCATTACTCGCACXCR7-shRNA-3-RTCCTGCTATTGCATTACTCGAGTGNegative-FTGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCTANegative-RTCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGA

1.3CXCR7-shRNA重組慢病毒表達載體的構建與包裝構建如下反應體系合成CXCR7-shRNA-1：10×Taqbuffer 2 μL，上下游引物各5 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，超純水7 μL，合成雙鏈oligo片段；根據慢病毒載體系統(tǒng)試劑盒說明，將pSilencerTM4.1載體線性化后純化回收，與上述構建完成的CXCR7-shRNA-1片段連接后轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆后擴增提取DNA片段，線性化后利用Lipofectamine 2000試劑轉染HEK293T細胞進行慢病毒包裝并進行滴度測定。同理構建另外兩組CXCR7-shRNA慢病毒載體及陰性對照。

1.4慢病毒表達載體的效率測定常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌細胞SW620，將上述3組實驗病毒液及1組對照病毒液分別以最佳感染指數(MOI=50)轉染后，培養(yǎng)48～72 h，待到細胞發(fā)生細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)后分別提取各組細胞的總RNA，按照RT-PCR一步法試劑盒說明書操作，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶吸光度值(A值)。重復上述實驗3次，選取沉默效率最高的一組病毒液作為轉染SW620的實驗組病毒液。

1.5轉染慢病毒后SW620細胞增殖的檢測常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌細胞SW620，傳至第3代對數生長期，于96孔板上接種，轉染上述沉默效率最高的慢病毒液(實驗組)，同時選取空白對照，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃溫箱孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO；在酶標儀上以波長490 nm測定各孔光吸收值，繪制細胞增殖曲線。

1.6SW620細胞劃痕實驗將生長狀態(tài)良好的第3代SW620細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，用1 000 μL槍頭在培養(yǎng)板中劃一直線，形成無細胞區(qū)域，再加入含沉默效率最高的慢病毒液(實驗組)和不加慢病毒液的培養(yǎng)基(空白對照組)分別培養(yǎng)細胞，在孵育0、24、48 h分別采集圖像。在圖像中劃痕的上、中、下3個位置，測量細胞“裸露”區(qū)域的寬度，并計算其平均值。用細胞遷移指數(migration index, MI)表示細胞遷移的快慢。

1.7轉染慢病毒后SW620細胞中CXCR7蛋白表達的檢測將沉默效率最高的一組慢病毒液作為實驗組(A)，與空病毒載體組(B)、空白組(C)分別轉染第3代SW620細胞后培養(yǎng)72 h，提取各組細胞總蛋白并定量；配制80 g/L分離膠與50 g/L濃縮膠，加樣后以60V-30 min，100V-1.5 h進行電泳；轉膜后麗春紅復染，洗脫3次孵育一抗(1∶1 000，兔抗人單克隆抗體)4 ℃過夜；孵育二抗(1∶1 500，羊抗兔多克隆抗體)室溫1h；用BCIP/NBT染色工作液避光室溫孵育3 h，凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶和內參照條帶。重復3次測A值，計算凈吸光度值。

2 結 果

2.1CXCR7-shRNA慢病毒載體的構建及包裝結果構建成功的3組慢病毒載體pSilencerTM 4.1-CXCR7-shRNA及1組陰性對照序列經測序檢測顯示無堿基突變，4組序列與預期DNA序列相符，說明合成的CXCR7-shRNA沉默序列插入正確，DNA重組成功，可進行后續(xù)實驗。測序由TaKaRa公司完成。慢病毒包裝系統(tǒng)轉染HEK293T細胞后72 h，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達，同時出現CPE現象：細胞觸角回收、腫脹變圓，一部分細胞脫落，懸浮于視野中(圖1、圖2)。病毒滴度測定為：CXCR7-shRNA-1，3.16×108pfu/mL；CXCR7-shRNA-2，4.27×108pfu/mL；CXCR7-shRNA-3，3.93×108pfu/mL；陰性對照2.95×108pfu/mL，均符合慢病毒RNAi實驗要求，可進行后續(xù)轉染實驗。

圖1慢病毒載體轉染HEK293T細胞后72h病毒包裝的觀察

Fig.1 Virus package of lentivirus vector transfection into HEK293T cell 72 hours later observed under common and fluorescence inverted microscopes (×40)

A：普通倒置顯微鏡觀察轉染效果；B：熒光倒置顯微鏡觀察轉染效果。

2.2慢病毒載體干擾效率的測定結果RT-PCR結果顯示，SW620細胞轉染3組CXCR7-shRNA及1組陰性對照后，A、B、C 3個實驗組的CXCR7 mRNA表達量相對于對照組(D組)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中CXCR7-shRNA-1轉染組(A組)的CXCR7 mRNA表達量明顯低于其他2實驗組(B、C組)，差異同樣具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明CXCR7-shRNA-1組(A組)對于結腸癌細胞SW620的CXCR7 mRNA的抑制率高于另外2組。因此，我們將選擇CXCR7-shRNA-1作為后續(xù)實驗的實驗組(圖2)。

2.3轉染慢病毒后SW620細胞增殖的檢測結果兩組SW620細胞分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后用MTT法檢測細胞密度(A值)，并根據酶標儀檢測的A值繪制細胞增殖曲線。結果表明，空白對照組(B組)SW620細胞生長迅速，實驗組(A組)經慢病毒液轉染后細胞增殖程度顯著減少，與B組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明慢病毒載體抑制CXCR7基因表達后可顯著抑制結腸癌細胞SW620的增殖(圖3)。

圖2RT-PCR檢測CXCR7mRNA的表達

Fig.2 CXCR7 mRNA expression detected by RT-PCR

A：CXCR7-shRNA-1；B：CXCR7-shRNA-2；C：CXCR7-shRNA-3；D：Negative-Control。

圖3轉染病毒后各時間段SW620細胞增殖生長曲線

Fig.3 SW620 cell proliferation and growth curve after virus transfection

2.4轉染慢病毒后SW620細胞遷移的檢測結果SW620細胞在劃痕24 h后，空白對照組和實驗組的細胞遷移指數(MI)分別為(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%，兩者相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，劃痕48 h后，空白對照組與實驗組的MI分別為(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%，兩者相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示，慢病毒液CXCR7-shRNA可以使SW620細胞的遠處遷移指數降低，進一步降低結腸癌細胞的細胞遷移能力(圖4)。

圖4CXCR7-shRNA對結腸癌細胞SW620遷移的影響

Fig.4 Effects on CXCR7-shRNA on SW620 cell migration of colon cancer(×40)

MI=100%(g0-gt)/g0，g0是指劃痕后立即采集圖像(0 h)時劃痕處“裸露”區(qū)測量的寬度，gt是指從劃痕細胞培養(yǎng)t h后采集圖像時劃痕處“裸露”區(qū)測量的寬度。

2.5轉染慢病毒后SW620細胞CXCR7蛋白的表達結果Western blot檢測結果可見，空病毒載體組(B)與空白組(C)CXCR7蛋白表達量明顯高于實驗組(A)，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而B、C兩組之間相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖5)。

圖5Westernblot檢測CXCR7蛋白表達

Fig.5 CXCR7 protein expression detected by Western blot

A：基因沉默實驗組；B：空病毒載體組；C：空白組。

3 討 論

惡性腫瘤的生長和轉移是一個極其復雜的過程，腫瘤細胞的異常增殖和遠處侵襲是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵步驟，其關鍵因子可以用來作為臨床靶向治療的研究目標[11]。趨化因子及其受體在多種腫瘤的增殖和遠處轉移中發(fā)揮了關鍵的作用，尤其是CXCL12-CXCR4/CXCR7生物學軸。與CXCR4類似，CXCR7也是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染CD4+淋巴細胞的協(xié)同受體[12]。目前的研究發(fā)現，配體活化的CXCR7可以極大的提高腫瘤細胞的生長增殖、粘附和轉移侵襲能力[13]。有研究表明，在高侵襲性的前列腺癌組織中CXCR7表達上調，而在采用CXCR7因子拮抗劑之后也可以抑制乳腺癌與肺癌的生長和轉移[14-15]。

shRNA是具有緊密發(fā)卡環(huán)結構的RNA序列，常被應用于RNAi技術特異性沉默靶基因的表達[16]。本實驗充分考慮了shRNA轉染成本低廉、轉染持久性及穩(wěn)定性好等特點，選擇其構建慢病毒載體介導的CXCR7-shRNA進行基因沉默實驗。在載體構建成功后，以載體中含有的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)作為示蹤因子，在病毒包裝后能夠很方便的通過熒光顯微鏡檢測包裝效果。實驗結果表明，3組CXCR7-shRNA慢病毒載體與陰性對照組在熒光顯微鏡下均有大量綠色熒光表達，表明攜帶有EGFP的慢病毒表達載體包裝成功，且轉染效率均可達80%以上。

RT-PCR檢測結果說明，實驗組的3種重組慢病毒載體CXCR7-shRNA轉染至結腸癌SW620細胞后，不同程度上使細胞內CXCR7的mRNA表達量降低，相對于陰性對照組有明顯的統(tǒng)計學意義，說明實驗組轉染SW620細胞成功，并成功抑制了該細胞中的CXCR7 mRNA的表達。從3組實驗組的CXCR7 mRNA表達量比較來看，CXCR7-shRNA-1組的抑制率比其他兩組略高，差異具有統(tǒng)計學意義，說明CXCR7-shRNA-1組的沉默效果最好，可用于后續(xù)轉染實驗。

在對SW620增殖抑制方面，我們通過MTT的方法發(fā)現轉染病毒后的24、48、72、96、120 h這5個時間段內，空白組(B組)癌細胞生長增殖迅速，呈現出對數上升的趨勢，而將實驗組(A組)轉染后腫瘤細胞增殖程度顯著減少，與B組相比有統(tǒng)計學差異，說明重組慢病毒載體CXCR7-shRNA-1通過抑制CXCR7基因表達后可進一步抑制結腸癌細胞SW620的增殖，證明了CXCR7基因在結腸癌的生長增殖過程中起到一定作用。

腫瘤細胞的侵襲和遷移是腫瘤進展的一個十分重要的環(huán)節(jié)[17]。我們通過細胞劃痕實驗研究發(fā)現，重組慢病毒載體CXCR7-shRNA-1能夠使SW620細胞的MI降低超過20%，能夠抑制SW620細胞劃痕的愈合的能力，即抑制結腸癌細胞的遠處侵襲和遷移能力，這是對于重組慢病毒載體CXCR7-shRNA-1對腫瘤細胞遷移能力影響的十分重要的結論。

對于CXCR7蛋白表達檢測結果來說，Western blot實驗證實，實驗組(A)轉染至結腸癌細胞SW620后，可以使細胞中的CXCR7蛋白表達量降低，相對于空病毒載體組(B)和空白組(C)有明顯的統(tǒng)計學意義；而空病毒載體組和空白組比較，CXCR7的蛋白表達量沒有明顯的變化，兩者之間差別沒有統(tǒng)計學的意義。結果證明，我們成功將shRNA片段轉染進SW620細胞，并成功抑制了細胞內部CXCR7蛋白的表達。由此可以推斷，CXCR7基因在結腸癌的增殖與侵襲轉移的機制中可能起到重要的作用，而通過慢病毒載體抑制CXCR7基因的表達對于我們下一步研究以CXCR7/CXCL12生物學軸為靶點的結直腸癌基因治療打下了良好的基礎，為該病毒載體的抗腫瘤效應提供了新的證據，為結直腸癌的基因治療提供了新的治療選擇。

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