MicroRNA-338-3p真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響

郭 波，王文靜，趙正豪，趙凌宇，汪魯敏，胡麗麗，宋土生，黃 辰,3

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系；2.第一附屬醫(yī)院肝膽外科； 3.心血管研究中心，陜西西安 710061)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼RNA小分子，是LEE等[1]于1993年在秀麗小桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)的，其長度約為21～25 nt，廣泛存在于真核生物中，大部分由基因的內(nèi)含子部位剪切產(chǎn)生。目前的研究表明，miRNA分子通過兩種[2-3]不同機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，當(dāng)miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA幾乎完全配對時，miRNA誘導(dǎo)mRNA降解，這種miRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制在植物中比較普遍；當(dāng)miRNA和編碼蛋白質(zhì)的mRNA不完全配對時，miRNA通過不完全的堿基配對結(jié)合mRNA的3’UTR，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因翻譯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[4]、周期[5]、侵襲轉(zhuǎn)移[6]及凋亡[7]，參與機(jī)體的發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過程。近期的研究結(jié)果表明，miR-338-3p在肝癌中能通過抑制SMO的表達(dá)而阻止肝癌細(xì)胞的遷移，提示miR-338-3p在腫瘤的發(fā)生過程中可能扮演類似抑癌基因的作用[8]。因此，本實(shí)驗擬采用真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，構(gòu)建miR-338-3p的特異性過表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p，并鑒定其在人胃癌SGC-7901細(xì)胞系中的表達(dá)活性與效率，探究miR-338-3p對SGC-7901細(xì)胞系增殖能力的影響，為后期深入研究miR-338-3p在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及基于miR-338-3p的基因靶向治療策略研究提供前期實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株和試劑質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR購自Invitrogen公司；Top10菌株為本實(shí)驗室保存；氨芐青霉素(新泰生物公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ及T4DNA連接酶(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)。

1.2miR-338-3p寡聚核苷酸合成通過生物信息學(xué)方法在miRbase查找miRNA-338-3p成熟體序列并在兩端構(gòu)建HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。Top oligo5′-AATTCTCTCCAACAATATCCTGGTGCTGA-GTGATGACTCAGGCGACTCCAGCATCAGTG-ATTTTGTTGAAGAA-3′；Bottom oligo 5′-AGCTTTCTTCAACAAAATCACTGATGCTGGAGTCG-CCTGAGTCATCACTCAGCACCAGGATATTGT-TGGAGAG-3′，序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3載體構(gòu)建與鑒定真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后片段，回收產(chǎn)物與退火成雙鏈的miR-338-3p DNA序列在T4DNA連接酶作用下于16 ℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)大腸桿菌，利用Amp抗性對重組子進(jìn)行篩選培養(yǎng)12 h，挑取陽性單克隆菌落，于LB(Amp+)液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)14h后送上海生工生物公司進(jìn)行DNA測序。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞系培養(yǎng)于含PS和胎牛血清FBS(Gibco公司)的DMEM(PAA公司)培養(yǎng)基中，并置于37 ℃的CO2孵育箱中，2～3 d換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗；設(shè)pcDNATM6.2空載體組為對照，實(shí)驗組按X-tremeGENE_HP_DNA_Transfection_Reagent(Roche公司)轉(zhuǎn)染試劑說明書瞬時轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表達(dá)載體的無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.5Real-timePCR檢測miR-338-3p在瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)Trizol提取SGC-7901細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent kit和Real time PCR試劑盒SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)均購自TaKaRa公司；PCR反應(yīng)引物序列：RT-primer：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCG-TGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCA-ACAAA-3′；Forward primer：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；Reverse primer：5′-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3′；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件：500 ng RNA，2 μL 5×PrimeScript?Buffer，0.5 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I，4.5 μL Rnase free water和1 μL stem loop RT primers，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；Real-time PCR反應(yīng)體系及條件：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExTaqⅡ，7 μL Rnase free water，1 μL Forward primer和1 μL Reverse primer，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.6MTT實(shí)驗調(diào)整細(xì)胞密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，利用MTT在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍(lán)紫色或藍(lán)黑色的MTT-甲肷，分別在第24、48、72 h取出細(xì)胞加入MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑嗅鹽]液，37 ℃孵育4 h后加入DMSO，利用酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔吸光度(A)值，以反映細(xì)胞數(shù)目并繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1pcDNATM-GW/EmGEP-miR-338-3p表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成的miR-338-3p DNA單鏈退火為雙鏈，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見70 bp大小目的條帶(圖1A)；LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體菌株，提取質(zhì)粒后用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收大片段，可見5 000 bp左右大小目的條帶(圖1B)。

圖1miR-338-3pDNAoligo退火及pcDNATM6.2的雙酶切

Fig.1 The product of miR-338-3p DNA oligo and pcDNA 6.2 by enzyme digestion

A：miR-338-3p人工合成DNA oligo退火產(chǎn)物電泳圖；B：pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后電泳圖。M：Marker。

2.2pcDNATM-GW/EmGEP-miR-338-3p表達(dá)載體的鑒定將LB(Amp+)抗體篩選的陽性單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后測序，與miR-338-3p DNA oligo序列進(jìn)行Blast比對可見完全匹配(圖2A)；構(gòu)建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p的表達(dá)圖譜(圖2B)。

2.3SGC-7901細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染及實(shí)時熒光定量PCR將構(gòu)建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系SGC-7901，Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-338-3p的表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，實(shí)驗組中miR-338-3p的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。

2.4過表達(dá)miR-338-3p抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表達(dá)載體后檢測miR-338-3p對細(xì)胞增殖能力的影響，MTT結(jié)果顯示(圖4)，48 h后實(shí)驗組中SGC-7901細(xì)胞的增殖有明顯降低(P<0.05)，提示miR-338-3p可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。

3 討 論

MiRNA可通過與mRNA匹配在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因翻譯，導(dǎo)致其靶基因的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生命活動[9]。一方面，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有原癌基因的作用，細(xì)胞的增殖研究發(fā)現(xiàn)miR-106b在前列腺癌、胃癌、食管癌、直腸癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，提示其可能為一種原癌基因[10]。PETROCCA等[11]發(fā)現(xiàn)miR-106b可負(fù)調(diào)節(jié)E2F1基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)高水平的E2F1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，被miR-106b負(fù)調(diào)節(jié)的E2F1可反式激活多種基因促進(jìn)細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換；另一方面，miRNA又可以抑制惡性腫瘤的發(fā)生，MOTT等[4]發(fā)現(xiàn)在33%的人膽管癌保本和膽管癌細(xì)胞系KMCH中miR-29b表達(dá)下調(diào)，通過在KMCH細(xì)胞中過表達(dá)miR-29b可促進(jìn)其Mcl-1蛋白的表達(dá)。Mcl-1基因是一種凋亡相關(guān)癌基因，其可通過抑制bax基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示miR-29b可作為膽管癌治療的靶分子。

圖2pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p表達(dá)載體的測序鑒定結(jié)果

Fig.2 The identification of pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p expression vector by sequencing

A：pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p表達(dá)載體與目的miR-338-3p序列blast比對結(jié)果及測序結(jié)果；B：將miR-338-3p的DNA序列插入到編輯區(qū)域成功構(gòu)建的pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-338-3p表達(dá)載體的圖譜。

圖3pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞表達(dá)水平

Fig.3 The expression level in SGC-7901 cells after transfected with pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p

*P<0.05。

圖4MTT法檢測miR-338-3p對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

Fig.4 The effect of miR-338-3p on the proliferation of SGC-7901 cells detected by MTT

*P<0.05。

MiRNA-338位于第17號染色體上，在不同物種間高度保守，由凋亡相關(guān)酪氨酸激酶(AATK)第七個內(nèi)含子編碼剪切為成熟的miRNA序列miR-338-3p和miR-338-5p，繼而在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮重要作用[12]。近來的研究顯示，miR-338-3p在包括胃癌等[13]多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，如在肝癌、惡性黑色素瘤[14]等腫瘤中的表達(dá)量受到抑制，而在口腔癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢[15]，HUANG等[8]的報道證明miR-338-3p可通過抑制SMO而阻止肝癌細(xì)胞的遷移。同時，ZHANG等[16]的研究應(yīng)用鳶尾黃酮抑制肺成纖維細(xì)胞生長，可以誘導(dǎo)miR-338-3p的表達(dá)上調(diào)，繼而抑制了miR-338-3p靶基因LPA1的表達(dá)。這些研究均提示，miR-338-3p在惡性腫瘤的發(fā)生過程中可能起到了重要的調(diào)控作用。

MiRNA在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)主要通過Ⅲ型啟動子來完成轉(zhuǎn)錄表達(dá)[17]，人為手段通過外源性miRNA干預(yù)細(xì)胞內(nèi)的miRNA表達(dá)水平是目前研究miRNA生物學(xué)功能的主要手段，包括腺病毒和慢病毒表達(dá)載體以及人工化學(xué)合成miRNA的模擬物(mimics)在內(nèi)的多種方法均能夠在細(xì)胞內(nèi)特異性的過表達(dá)某種特定的miRNA，而其中miRNA質(zhì)粒真核表達(dá)載體的構(gòu)建因其具有價格低廉、方法簡便，能夠模擬內(nèi)源性miRNA前體的剪切過程等優(yōu)點(diǎn)仍得到了廣泛的應(yīng)用。pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR是一種真核表達(dá)的特異性表達(dá)質(zhì)粒，可通過轉(zhuǎn)錄提高細(xì)胞內(nèi)特異性miRNA的表達(dá)水平，同時表達(dá)綠色熒光蛋白有利于鑒定轉(zhuǎn)染效率。

在本研究中，我們以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體為基礎(chǔ)，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切和純化后與人工合成miR-338-3p的寡聚核苷酸進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10后，經(jīng)過DNA測序、BLAST檢測及驗證，結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了miR-338-3p特異性表達(dá)載體；將構(gòu)建成功的無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞中，24 h通過Real time PCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-338-3p特異性表達(dá)載體后的SGC-7901實(shí)驗組中miR-338-3p的表達(dá)量顯著高于對照組；重要的是通過MTT實(shí)驗，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-338-3p的實(shí)驗組中SGC-7901細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，提示miR-338-3p可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮類似抑癌基因的功能，利用真核表達(dá)載體外源性表達(dá)miR-338-3p能夠成為有效抑制胃癌細(xì)胞生長的重要手段，并為后期深入研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEE RC, FEINBAUM RL, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[2] MISHRA PJ, BERTINO JR. MicroRNA polymorphisms: the future of pharmacogenomics, molecular epidemiology and individualized medicine[J]. Future Med, 2009, 10(3):399-416.

[3] SCHWARZ DS, HUTVAGNER G, DU T, et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex[J]. Cell, 2003, 115(2):199-208.

[4] NG E, TSANG W, NG S, et al. MicroRNA-143 targets DNA methyltransferases 3A in colorectal cancer[J]. Brit J Cancer, 2009, 101(4):699-706.

[5] HE L, HE X, LIM LP, et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network[J]. Nature, 2007, 447(7148):1130-1134.

[6] MENG F, HENSON R, WEHBE-JANEK H, et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J]. Gastroenterology, 2007, 133(2):647-658.

[7] JOHNSON DG, DEGREGORI J. Putting the oncogenic and tumor suppressive activities of E2F into context[J]. Curr Mol Med, 2006, 6(7):731-738.

[8] HUANG XH, CHEN JS, WANG Q, et al. miR-338-3p suppresses invasion of liver cancer cell by targeting smoothened[J]. J Pathol, 2011, 225(3):463-472.

[9] BARTEL DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009, 136(2):215-233.

[10] VISONE R, CROCE CM. MiRNAs and cancer[J]. Am J Pathol, 2009, 174(4):1131-1138.

[11] PETROCCA F, VECCHIONE A, CROCE CM. Emerging role of miR-106b-25/miR-17-92 clusters in the control of transforming growth factor β signaling[J]. Cancer Res, 2008, 68(20):8191-8194.

[12] KOS A, LOOHUIS NFO, WIECZOREK ML, et al. A potential regulatory role for intronic microRNA-338-3p for its host gene encoding apoptosis-associated tyrosine kinase[J]. Plos One, 2012, 7(2):e31022.

[13] LI X, ZHANG Y, ZHANG Y, et al. Survival prediction of gastric cancer by a seven-microRNA signature[J]. Gut, 2010, 59(5):579-585.

[14] CARAMUTA S, EGYHAZI S, RODOLFO M, et al. MicroRNA expression profiles associated with mutational status and survival in malignant melanoma[J]. J Invest Dermatol, 2010, 130(8):2062-2070.

[15] SCAPOLI L, PALMIERI A, LO ML, et al. MicroRNA expression profiling of oral carcinoma identifies new markers of tumor progression[J]. Int J Immunopath Ph, 2010, 23(4):1229.

[16] ZHANG H, LIU X, CHEN S, et al. Tectorigenin inhibits theinvitroproliferation and enhances miR-338 expression of pulmonary fibroblasts in rats with idiopathic pulmonary fibrosis[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 131(1):165-173.

[17] LI SC, TANG P, LIN WC. Intronic microRNA: discovery and biological implications[J]. Dna Cell Biol, 2007, 26(4):195-207.