自發(fā)性高血壓大鼠海馬區(qū)MCP-1、COX-2、NF-κB表達及神經(jīng)元損傷的增齡性變化

李雅麗，張巧俊，袁海峰，張 妮，郭方圓，牛小麟，羅 昆

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腦病科，陜西西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710004；3.西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003)

高血壓可致靶器官結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，是腦卒中的主要危險因素。既往對高血壓腦損傷的關(guān)注多集中于腦血管病變導(dǎo)致腦卒中后出現(xiàn)的腦組織結(jié)構(gòu)和功能改變，而高血壓在并發(fā)腦卒中前就已經(jīng)存在一定的高級神經(jīng)功能障礙，主要表現(xiàn)為認知功能損害。因此，腦卒中前高血壓腦損傷研究已逐漸引起學(xué)者關(guān)注。近年來，研究顯示慢性炎癥是高血壓病理進展的一個重要機制，在高血壓腦損傷中扮演重要角色，炎癥因子如IL-1b等通過各自的下游信號通路，可引發(fā)神經(jīng)元損傷甚至死亡[1]。但是，目前尚無關(guān)于高血壓腦內(nèi)炎癥通路的增齡性活化及損傷的研究及報道。探討高血壓腦損傷過程中的炎癥反應(yīng)機制，將為其治療開辟新的道路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和威斯塔京都大鼠(WKY)各15只，均購自上海SLAC實驗動物中心。隨機分為3組，每組5只：16周齡(16周)組、32周齡(32周)組和64周齡(64周)組。標準環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，到達相應(yīng)周齡時，尾動脈測壓后處死取腦。

1.2主要試劑B-巰基乙醇、TEMED購于Sigma公司；Sample protectors、RNAiso、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix ExTaqTMⅡ均購自TaKaRa公司。NF-κB兔抗大鼠、β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗體均購自Bioworlde公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠二抗及ECL試劑盒購自Amersham公司。

1.3方法

1.3.1大鼠尾動脈測壓 大鼠在正式實驗前，進行為期1周的尾動脈測壓預(yù)適應(yīng)，然后將tail-cuff壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，調(diào)整標壓，將tail-cuff壓力換能器纏繞于待測大鼠尾根部，充氣后測量各組大鼠尾動脈收縮壓。

1.3.2標本收集及測定 各組大鼠達相應(yīng)周齡尾動脈測壓后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(500 mg/kg)，麻醉后處死，冰上剝離鼠腦。用預(yù)冷的生理鹽水洗凈表面血液并吸干殘留水分后，一部分貯存在標本保護液(sample protector, TaKaRa)，液氮中保存以便進行Real time PCR及Western blot檢測。另一部分迅速貯存在預(yù)冷的新鮮40 g/L多聚甲醛中，4 ℃過夜，石蠟包埋，用于甲苯胺藍染色檢測。

1.3.3甲苯胺藍染色 切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ和梯度乙醇脫蠟入水，甲苯胺藍染色10 min，700 mL/L乙醇分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。觀察每只大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，每個大鼠3張切片，選取層面為前囟后3.72～3.96 mm，40倍目鏡下隨機取5個視野，圖像分析儀(Q550CW，德國萊卡公司)計數(shù)單位面積神經(jīng)元數(shù)量。

1.3.4Realtime FQ-PCR分析 Trizol法提取各組大鼠海馬區(qū)總RNA，PrimeScript RT Master Mix盒子(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Premix ExTaqTMⅡ Kit(TaKaRa)進行Realtime FQ-PCR實驗。MCP-1(上游序列：5′-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3′，下游序列：5′-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3′)、COX-2(上游序列：5′-CGGAGGAGAAGTGGGGTTT-3′，下游序列：5′-GTTGATGGTGGCTGTCTTGG-3′)和β-actin(上游序列：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游序列：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′)，序列均由TaKaRa公司設(shè)計并合成。在iQ Multicolor Real-Time PCR Detection system(Bio-Rad, Hercules, CA)儀器進行Realtime FQ-PCR實驗。每個基因的mRNA水平都用其β-actin mRNA水平來調(diào)整。Ct值由Bio-Rad iQ5 2.0標準edition optical 系統(tǒng)軟件獲得，并用2-△△Ct法分析。每組3個樣，進行3次獨立實驗。

1.3.5Western blot檢測 從Sample protector里取出海馬組織后提取蛋白質(zhì)，BCA測試盒測定各組蛋白質(zhì)濃度，并調(diào)整一致，蛋白變性后制取120 g/L瓊脂糖凝膠，各組等量上樣進行電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。100 g/L脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠NF-κB(1∶1 000，Bioworlde)及小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000，Bioworlde)多克隆抗體，4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔或羊抗小鼠IgG)孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X光片記錄結(jié)果。蛋白條帶進行相對密度掃描并分析。

2 結(jié) 果

2.1血壓監(jiān)測結(jié)果對SHR、WKY組大鼠達16、32、64周齡時進行尾動脈測壓，結(jié)果顯示，不同周齡SHR組大鼠SBP均較同齡WKY組大鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。SHR組3個年齡段間比較，32周、64周組較16周組SBP均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但32周和64周兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同周齡WKY組之間SBP比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1各組大鼠血壓檢測結(jié)果

Tab.1 The results of blood pressure in different groups

mmHg)

與WKY組比較，*P<0.01；與16周SHR組比較，**P<0.01。2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果高倍鏡下觀察，各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核著色不明顯，核內(nèi)有1～3個深藍色核仁，周圍胞質(zhì)內(nèi)可見染成藍色的顆粒狀物質(zhì)，即為尼氏小體。SHR、WKY組神經(jīng)元數(shù)目均呈現(xiàn)增齡性遞減趨勢，其中，16周SHR、WKY組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體數(shù)量較多、染色較深；隨增齡，32周、64周SHR組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量減少、染色變淡，呈現(xiàn)不同程度的溶解，提示其神經(jīng)元存在損傷(圖1)。

圖1各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果

Fig.1 Nissl’s staining of CA1 subfield of the hippocampus in different groups (×400, Bar=50 μm)

A、B、C：SHR組16周、32周和64周；D、E、F：WKY組 16周、32周和64周。

比較各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積的神經(jīng)元數(shù)目，可以觀察到，SHR和WKY組單位面積神經(jīng)元數(shù)目隨增齡均逐漸減少，SHR組更為顯著。32周和64周SHR組單位面積神經(jīng)元數(shù)目均明顯少于16周組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P<0.05，P<0.01)，64周較32周組差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而WKY組中，64周較16周組單位面積神經(jīng)元數(shù)目也明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與同年齡WKY組相比，32周、64周SHR組單位面積神經(jīng)元數(shù)目均顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P<0.05，P<0.01，圖2)。

2.3海馬區(qū)COX-2、MCP-1mRNA的表達水平如圖3所示：SHR組COX-2、MCP-1 mRNA表達水平均呈現(xiàn)增齡性升高趨勢，32周、64周SHR組COX-2、MCP-1 mRNA表達水平均較16周SHR組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但32周和64周兩組之間COX-2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，MCP-1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。較同年齡WKY組，32周和64周SHR組COX-2、MCP-1 mRNA表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。此外，可以觀察到，64周WKY組COX-2、MCP-1 mRNA表達水平均較16周WKY組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)目比較

Fig.2 Comparison of the number of neurons in CA1 subfield of the hippocampus in different groups

與16周SHR組比較，#P<0.05；與32周SHR組比較，##P<0.01；與同周齡WKY組比較，*P<0.05，*P<0.01；與16周WKY組比較，△P<0.05。

圖3各組大鼠海馬組織中COX-2、MCP-1mRNA表達水平的比較

Fig.3 Comparison of COX-2 and MCP-1 mRNA expressions in the hippocampus of different groups

與16周SHR組比較，#P<0.01；與32周SHR組比較，##P<0.05；與同周齡WKY組比較，*P<0.01；與16周WKY組比較，△P<0.05。

2.4海馬區(qū)NF-κB蛋白表達的水平如圖4所示，SHR、WKY組海馬區(qū)NF-κB蛋白表達水平呈現(xiàn)隨增齡而逐漸升高趨勢。SHR組間兩兩相較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；WKY組間相較，64周較16周組NF-κB蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。較同年齡WKY組，32周和64周SHR組NF-κB蛋白表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P<0.05，P<0.01)。

圖4各組大鼠海馬組織中NF-κB蛋白表達水平比較

Fig.4 The protein expression of NF-κB in the hippocampus of different groups

與16周SHR組比較，#P<0.01；與32周SHR組比較，##P<0.01；與同周齡WKY組比較，△P<0.05、*P<0.01；與16周 WKY組比較，&P<0.01。

3 討 論

卒中前高血壓腦損傷研究已逐漸引起學(xué)者關(guān)注，其主要病理變化為長期慢性缺血缺氧所致的神經(jīng)元凋亡，累及與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的腦區(qū)。但既往對高血壓腦損傷的研究多集中在某一年齡段，系統(tǒng)報道高血壓腦損傷增齡性變化的研究較少。COX-2和MCP-1作為炎癥反應(yīng)的重要生物學(xué)指標，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)其在高血壓腦損傷中的作用卻少見報道。NF-кB在多種疾病中參與對炎癥介質(zhì)的調(diào)控，其是否參與高血壓腦損傷并對參與其中的炎癥介質(zhì)具有調(diào)控作用？本研究以SHR作為研究對象將就如上疑問進行探討。

SHR出生時血壓正常，在3～6個月時發(fā)展為持續(xù)高血壓，其時間依賴性的動脈血壓升高、腦萎縮、神經(jīng)細胞缺失、膠質(zhì)細胞反應(yīng)的出現(xiàn)都與人類原發(fā)性高血壓有相似的特征，是一種研究高血壓腦損傷的合理模型[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，長期高血壓主要累及額葉、枕葉皮質(zhì)、海馬等與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)的腦區(qū)[3]，隨高血壓狀態(tài)持續(xù)，海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回體積逐漸縮小，神經(jīng)元丟失范圍逐漸擴大[4]。本實驗發(fā)現(xiàn)，較同年齡配對WKY組，32周、64周SHR組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞明顯減少，64周組更顯著。提示隨年齡增加、血壓升高，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失逐漸增多，這可能是中、老年高血壓患者認知下降的細胞學(xué)基礎(chǔ)。選用同年齡配對的WKY組作為對照，剔除了年齡等混雜因素干擾。結(jié)果證實，高血壓是海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少的獨立危險因素。有學(xué)者為剔除年齡對記憶功能的影響，選擇中年高血壓患者作為研究對象，發(fā)現(xiàn)其記憶功能較對照組明顯減退，提示高血壓是記憶障礙的獨立危險因素[5]。本結(jié)果與此一致。但是，我們也觀察到，無高血壓的WKY組3個年齡段之間比較，64周較16周組神經(jīng)元數(shù)目有所減少。已知64周大鼠約相當于人類的中老年階段，推測衰老可能是64周WKY組神經(jīng)元減少的主要原因。這也與既往研究結(jié)果一致。隨衰老進行，海馬組織抗氧化能力降低，海馬CA1區(qū)錐體細胞出現(xiàn)退行性變化[6]，提示衰老也是神經(jīng)元凋亡的獨立危險因素。特定腦區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目與神經(jīng)系統(tǒng)接收、分析及貯存信息的能力可能相關(guān)，在SHR及老年WKY大鼠中觀察到的海馬區(qū)更少的神經(jīng)元數(shù)目提示其腦功能可能正在發(fā)生進行性損傷。

COX-2是合成前列腺素過程中最重要的限速酶，腦組織中含量最高，主要在海馬和顳葉皮質(zhì)的神經(jīng)細胞膜上低水平表達。多種病理刺激、細胞因子能夠誘導(dǎo)COX-2過度表達，并通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與組織損傷。近年來，有研究證實COX-2與高血壓發(fā)生關(guān)系密切，可加重高血壓患者體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷[7-8]。本研究觀察到32、64周SHR組海馬區(qū)COX-2表達水平顯著高于同周齡WKY組，提示COX-2可能在高血壓引發(fā)腦損傷過程中發(fā)揮著重要作用。這與以往有關(guān)COX-2與腦損傷關(guān)系的研究結(jié)果一致。有研究證實，COX-2的表達水平在急性腦缺血大鼠[9]與慢性腦缺血老齡大鼠[10]腦組織中明顯升高，提示COX-2廣泛參與缺血后炎癥反應(yīng)所致的腦組織損傷。MCP-1屬于趨化因子，可由單核-巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞等多種細胞分泌。作為炎癥反應(yīng)進程中的重要環(huán)節(jié)，MCP-1可趨化炎癥細胞轉(zhuǎn)移至炎癥部位，并激活炎癥細胞使其合成釋放大量炎癥介質(zhì)，引發(fā)組織受損[11]。近來，有臨床試驗研究高血壓與炎癥標志物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MCP-1隨高血壓進展持續(xù)升高[12]。本研究中SHR各周齡組COX-2、MCP-1表達水平變化呈現(xiàn)增齡性升高趨勢，提示隨增齡，高血壓腦內(nèi)炎癥損傷增強，這可能是海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥介質(zhì)如COX-2、MCP-1、IL-1、IL-6的基因啟動子上均存在NF-κB的結(jié)合位點，當NF-κB與之結(jié)合后，基因即被激活開始轉(zhuǎn)錄表達[13]。RODRIGUEZ等[14]發(fā)現(xiàn)SHR體內(nèi)NF-κB蛋白水平升高，多種組織內(nèi)有明顯的炎癥細胞浸潤，而腹膜注射NF-κB抑制劑PDTC(烷二硫代氨基甲酸)，可使NF-κB蛋白水平恢復(fù)正常，組織間未見明顯炎癥細胞浸潤，提示NF-κB可能通過調(diào)控炎癥介質(zhì)釋放參與了高血壓組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與MCP-1、COX-2 mRNA表達變化一致，SHR組內(nèi)NF-κB表達隨增齡逐漸升高，且32周、64周SHR組NF-κB蛋白表達均較同齡WKY組明顯升高，提示NF-κB可能對COX-2、MCP-1的表達具有調(diào)控作用。表達上調(diào)的NF-κB與COX-2和MCP-1的基因啟動子結(jié)合，使COX-2和MCP-1基因激活后轉(zhuǎn)錄表達水平上調(diào)，從而參與了高血壓海馬區(qū)神經(jīng)元損傷過程。

總之，在高血壓腦損傷中，炎癥介質(zhì)COX-2、MCP-1發(fā)揮著重要作用，且COX-2與MCP-1可能具有共同的調(diào)控機制。NF-κB在高血壓腦損傷中扮演著重要角色，可能對COX-2和MCP-1的表達起調(diào)控作用，有可能成為治療高血壓腦損傷新的干預(yù)靶點。

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