束縛應(yīng)激對(duì)小鼠血漿α-klotho蛋白及腎臟α-klotho mRNA表達(dá)的影響

楊 偉，蘇顯明，王 穎，王 瑛，馬 奕

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1. 老年心血管內(nèi)科；2. 腫瘤內(nèi)科；陜西西安 710061)

α-klotho是學(xué)者在研究鹽敏感性高血壓小鼠過(guò)程中，為觀察單基因插入突變所致表型變化而發(fā)現(xiàn)的[1]。自從發(fā)現(xiàn)該基因以來(lái)，學(xué)者們做了大量關(guān)于其功能的研究。現(xiàn)在已知其表達(dá)產(chǎn)物有兩種：一種是膜型α-klotho蛋白，為成纖維生長(zhǎng)因子的共受體；另一種是分泌型蛋白，其作為內(nèi)分泌激素，不依賴成纖維生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用[2]。α-klotho功能取決于上述兩種蛋白，現(xiàn)在已知其抗衰老效應(yīng)主要來(lái)自膜型蛋白，與參與生物體鈣磷代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，而分泌型蛋白的功能有待進(jìn)一步研究。

2004年TAKESHITA等在束縛應(yīng)激條件下研究α-klotho敲除鼠，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中α-klotho敲除鼠較野生型鼠表現(xiàn)出高死亡率(20/30)的特點(diǎn)，死亡的原因?yàn)楦]房阻滯及竇性停博，非心梗、腦出血等[3]。然而，α-klotho敲除鼠束縛應(yīng)激過(guò)程中死亡原因的機(jī)制仍有待闡明?；谏鲜鲅芯浚覀兲岢鲞@樣一種假設(shè)：束縛應(yīng)激改變了野生型小鼠分泌型或膜型α-klotho蛋白的含量，正是這種α-klotho蛋白含量的變化致使下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能緩沖應(yīng)激所致內(nèi)環(huán)境的有害刺激。而α-klotho敲除鼠缺乏這種緩沖有害刺激的能力，最終死于病態(tài)竇房結(jié)綜合征。

因此，這個(gè)假設(shè)能否成立的前體條件在于束縛應(yīng)激能否改變膜型或分泌型α-klotho蛋白的含量或α-klotho mRNA的表達(dá)。本文就束縛應(yīng)激對(duì)α-klotho的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料C57BL6/J小鼠(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SYXK(陜)2007-003)；肝素鈉(海通藥業(yè)有限公司，成都，中國(guó))，離心機(jī)(Eppendorf 5415R，紐約，美國(guó))；RNAiso Plus(TaKaRa公司，大連，中國(guó))，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司，大連，中國(guó))，iCycler iQ5TMReal Time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories，加利福利亞，美國(guó))，SYBRPremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa公司，大連，中國(guó))，Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit(USCN公司，武漢，中國(guó))，分光光度計(jì)(FLUOstar OPTIMA，奧芬堡，德國(guó))，SPSS for Windows Release 19.0(SPSS，芝加哥，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為5周齡雄性C57BL6/J小鼠(約17 g)，共48只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組8只共同飼養(yǎng)在一個(gè)通氣良好的飼養(yǎng)籠內(nèi)，飼養(yǎng)室溫度保持在(16±1)℃，相對(duì)濕度在(55±5)%，行春季自然光照節(jié)律。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(6周，約20 g)前所有動(dòng)物先適應(yīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周，隨意給予食物和水。

1.3應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的實(shí)施方案束縛應(yīng)激組小鼠均置于水平放置的50 mL錐形離心管中，離心管置于鏤空的飼養(yǎng)架上，離心管管周開密集通風(fēng)口(通風(fēng)口不宜過(guò)大，以防小鼠試驗(yàn)中破壞管壁逃跑)保持良好通氣，限制其身體自由移動(dòng)，試驗(yàn)中遠(yuǎn)離食物及水，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人為及機(jī)械的各種噪音，保持周圍環(huán)境溫度及濕度相對(duì)恒定等，以控制實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素以外的應(yīng)激因素。對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中脫離原飼養(yǎng)環(huán)境，置于無(wú)墊料、食物及水源的空飼養(yǎng)盒內(nèi)，其他條件均與束縛應(yīng)激組保持一致。

應(yīng)激實(shí)驗(yàn)進(jìn)行階段，所有動(dòng)物遠(yuǎn)離水和食物。20 h 組實(shí)驗(yàn)開始于第1天中午12點(diǎn)結(jié)束于次日晨8點(diǎn)；10 h組實(shí)驗(yàn)開始于晨8點(diǎn)至下午6點(diǎn)；1 h組實(shí)驗(yàn)開始于中午12點(diǎn)至下午1點(diǎn)。

1.4標(biāo)本采集束縛應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在2 min內(nèi)立即從眶上靜脈途徑采血，血液存儲(chǔ)于行肝素抗凝的EP管中，置于EP管中的血液于Eppendorf 5415R離心機(jī)中離心，離心參數(shù)為4 ℃，1 500×g，15 min。血標(biāo)本采集后，立即麻醉處死小鼠后取出雙側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗后，于液氮中速凍，后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.5腎臟α-klothomRNA表達(dá)變化的檢測(cè)用RNAiso Plus提取腎臟總RNA后，取0.8 μg總RNA利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA片段包含位于第3個(gè)外顯子的選擇性剪切位點(diǎn)。為確定α-klotho mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)中使用了實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為25 μL(包含2 μL的模板cDNA，1 μL各條引物，12.5 μL的SYBR Premix ExTaqTMⅡ)，使用Gapdh作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s 40循環(huán)，60 ℃ 30 s。引物序列如表1所示。

表1RT-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小

Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

引物名稱序列(5'→3')擴(kuò)增產(chǎn)物片段(bp)α-klotho primer 1α-klotho primer 2CGCAAAGTGCTCAACTGGCTAAAAGGTTGATGTCGTCCAACACGTA150Gapdh primer 1Gapdh primer 2TGTGTCCGTCGTGGATCTGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG171

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性經(jīng)溶解曲線及瓊脂糖凝膠電泳確定。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.6血漿α-klotho蛋白及皮質(zhì)酮濃度的測(cè)定血漿α-klotho蛋白和皮質(zhì)酮水平均采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定，在(450±10)nm波長(zhǎng)下于FLUOstar OPTIMA分光光度計(jì)中測(cè)定樣本吸光度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度及濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，后據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本濃度。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物模型符合應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的要求本研究采用經(jīng)典的束縛應(yīng)激實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?lái)研究應(yīng)激對(duì)α-klotho蛋白及基因表達(dá)的影響。為評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?，消除晝夜?jié)律對(duì)血皮質(zhì)酮濃度的影響，實(shí)驗(yàn)中引入監(jiān)控應(yīng)激強(qiáng)度檢測(cè)指標(biāo)-皮質(zhì)酮及設(shè)立對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均測(cè)定皮質(zhì)酮水平。既往研究資料表明，如果小鼠皮質(zhì)酮水平較無(wú)應(yīng)激狀態(tài)高2倍以上，應(yīng)激強(qiáng)度即符合要求，達(dá)到應(yīng)激處理的目的。雖然在束縛應(yīng)激組與對(duì)照組中，血漿皮質(zhì)酮濃度與現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)有差距，但各束縛應(yīng)激組較其對(duì)照組倍數(shù)變化關(guān)系有意義，1、10、20 h束縛應(yīng)激組較各自對(duì)照組血漿皮質(zhì)酮濃度變化倍數(shù)依次為2.03、2.52和2.34，說(shuō)明應(yīng)激強(qiáng)度符合要求，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。束縛應(yīng)激組與對(duì)照組皮質(zhì)酮水平如圖1所示。

圖1不同處理時(shí)間組組內(nèi)皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度變化的比較

Fig.1 Comparison of corticosterone concentration in different treatment time subgroups

與各組內(nèi)對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2束縛應(yīng)激增高血漿α-klotho蛋白質(zhì)量濃度基于上述小鼠束縛應(yīng)激模型的評(píng)估結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用上述應(yīng)激實(shí)驗(yàn)方案。目前，關(guān)于血漿α-klotho質(zhì)量濃度的正常范圍尚無(wú)統(tǒng)一研究結(jié)果，且不同研究得出不盡相同的結(jié)論[4]。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得血漿α-klotho質(zhì)量濃度與另一研究的結(jié)果(10 nmol/L到50 nmol/L)[5]部分一致。1、10 h和20 h對(duì)照亞組血α-klotho蛋白濃度分別為(757.71±333.93)、(687.38±342.79)、(912.90±337.8)pg/mL；束縛應(yīng)激亞組分別為(726.40±342.79)、(1 261.54±442.71)、(1 696.18 ± 404.11)pg/mL。對(duì)照亞組各組之間血α-klotho蛋白質(zhì)量濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但20 h組較其他兩組稍高。1 h束縛應(yīng)激亞組與對(duì)照亞組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而10 h與20 h束縛應(yīng)激亞組血α-klotho蛋白與其各自對(duì)照亞組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。不同處理時(shí)間組血漿α-klotho蛋白質(zhì)量濃度的變化情況如圖2所示。

圖2不同處理時(shí)間組血漿α-klotho蛋白質(zhì)量濃度的變化

Fig.2 Comparison of serum α-klotho protein concentration in different treatment time groups

與組內(nèi)對(duì)照組比較，*P<0.05；與1 h束縛應(yīng)激組比較，#P<0.05。

2.3束縛應(yīng)激使腎臟α-klothomRNA的表達(dá)減低PCR的擴(kuò)增曲線、溶解曲線及擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3α-klotho基因(A)和Gapdh基因(C)的擴(kuò)增曲線及α-klotho基因(B)和Gapdh基因(D)的溶解曲線

Fig.3 Fluorescent curves of α-klotho (A) and Gapdh (C), dissociation curves of α-klotho (B) and Gapdh (D)

我們觀察到腎臟α-klotho mRNA的表達(dá)在束縛應(yīng)激進(jìn)行1 h的時(shí)候已經(jīng)輕微降低了，但這種改變尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顯著降低發(fā)生在10 h與20 h束縛應(yīng)激組，腎臟α-klotho mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組分別減低2.02倍和2.46倍(表2)。

圖4小鼠腎臟α-klotho和Gapdh的RT-PCR結(jié)果

Fig.4 RT-PCR products of α-klotho and Gapdh in mice renal tissues

1～4：Gapdh的RT-PCR結(jié)果(片段長(zhǎng)度為171 bp)；5～8：α-klotho RT-PCR結(jié)果(片段長(zhǎng)度為150 bp)；M：Marker。

表2不同處理時(shí)間組腎臟α-klothomRNA表達(dá)變化的比較

Tab.2 Comparison of the expression of renal α-klotho mRNA in different treatment time groups

組 別ΔCT1(kla-Gapdh)ΔCT2(klb-Gapdh)ΔΔCT(ΔCT1-ΔCT2)束縛應(yīng)激組較其對(duì)照組表達(dá)減低倍數(shù)1h組4.91±0.384.74±0.500.171.1310h組6.58±0.205.77±0.301.012.02#20h組6.59±0.595.29±0.361.302.46#

Gapdh：內(nèi)參CT值；kla：束縛應(yīng)激組CT值；klb：對(duì)照組CT值；#P<0.05，與1 h束縛應(yīng)激組比較。

3 討 論

研究表明，應(yīng)激主要通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸，交感-腎上腺髓質(zhì)軸及阿片系統(tǒng)發(fā)揮作用。TAKESHITA等[3]研究表明，在束縛應(yīng)激條件下野生型小鼠血漿去甲腎上腺素增高，而α-klotho敲除鼠血漿去甲腎上腺素水平卻輕度降低。許多學(xué)者都曾研究過(guò)皮質(zhì)酮這一鼠類主要的應(yīng)激激素，結(jié)果表明應(yīng)激使血漿皮質(zhì)酮濃度顯著增高[6]，同時(shí)皮質(zhì)酮能誘導(dǎo)胰島素抵抗[7]。而諸多研究表明對(duì)胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的適當(dāng)抑制能延長(zhǎng)動(dòng)物壽命，α-klotho正是通過(guò)這一方式發(fā)揮抗衰老作用的[8]。在這種情形下，因α-klotho 與皮質(zhì)酮存在誘導(dǎo)胰島素抵抗這一共同點(diǎn)，故α-klotho與皮質(zhì)酮或其他應(yīng)激激素之間在抗衰老方面是否存在關(guān)系，需要更多更深入的研究來(lái)闡明。

本研究所用束縛應(yīng)激模型為急性束縛應(yīng)激模型，束縛應(yīng)激過(guò)程中出現(xiàn)血漿α-klotho蛋白濃度增高的現(xiàn)象，故支持α-klotho蛋白作為一種急性期蛋白，但其具體功能尚待進(jìn)一步研究闡明。這一現(xiàn)象表面上看來(lái)與腎臟組織α-klotho mRNA表達(dá)減低相矛盾，推測(cè)其原因?yàn)橐韵?個(gè)方面：①分泌型α-klotho有兩種生成方式：α-klotho mRNA選擇性拼接后表達(dá)和膜型α-klotho胞外域直接從膜上脫落形成[9]。如果是第1種生成方式，那么血漿中α-klotho濃度的升高，必然伴隨α-klotho mRNA表達(dá)的升高，但事實(shí)卻是表達(dá)減低，故推測(cè)出現(xiàn)血α-klotho蛋白濃度升高，而主要表達(dá)α-klotho的腎臟組織α-klotho mRNA減低，這一看似矛盾現(xiàn)象的原因是α-klotho存在第2種生成方式，這也與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。分泌型α-klotho的產(chǎn)生主要來(lái)自膜型α-klotho蛋白胞外域的脫落，故推測(cè)束縛應(yīng)激主要是通過(guò)增加膜型α-klotho蛋白的脫落從而提高血漿α-klotho蛋白濃度，發(fā)揮急性期蛋白的相關(guān)作用。解釋了這一看似矛盾的現(xiàn)象后，仍有兩個(gè)問(wèn)題有待解決：束縛應(yīng)激是如何促使膜型α-klotho胞外域脫落及下調(diào)腎臟組織α-klotho mRNA表達(dá)的，前面我們探討了應(yīng)激現(xiàn)象的作用軸，故我們推測(cè)作為嚙齒類動(dòng)物的小鼠，皮質(zhì)酮為其主要的應(yīng)激激素，束縛應(yīng)激有可能通過(guò)改變血漿皮質(zhì)酮及其他應(yīng)激激素濃度，從而出現(xiàn)相應(yīng)改變，這仍待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。②有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)FGF-23能直接或間接增加血α-klotho蛋白濃度及減低α-klotho mRNA的表達(dá)[10]，但束縛應(yīng)激能否改變FGF-23的濃度及機(jī)制仍有待闡明。③研究表明持續(xù)的循環(huán)壓力如高血壓，糖尿病和由氧化應(yīng)激、代謝紊亂及脂多糖誘發(fā)的急性炎癥都能下調(diào)α-klotho的表達(dá)[11]。

在本研究中，我們觀察到小鼠在束縛應(yīng)激過(guò)程中表現(xiàn)出大量出汗及因恐懼小便失禁等現(xiàn)象。我們認(rèn)為即使因出汗導(dǎo)致低血容量的發(fā)生，機(jī)體應(yīng)激所致血流再分配，也與腎臟α-klotho mRNA表達(dá)減低沒(méi)有關(guān)系，因現(xiàn)有研究表明通過(guò)放血所致低血容量未下調(diào)α-klotho mRNA的表達(dá)，但有可能與血流重新分配，致腎臟相對(duì)缺血缺氧，從而導(dǎo)致局部組織代謝紊亂，加重氧化應(yīng)激有關(guān)系，因現(xiàn)有證據(jù)表明氧化應(yīng)激可下調(diào)α-klotho mRNA的表達(dá)[12]。

綜上所述，束縛應(yīng)激可能是通過(guò)改變皮質(zhì)酮、腎上腺素等濃度，再通過(guò)某一作用方式作用于腎臟膜型α-klotho蛋白，導(dǎo)致膜型α-klotho胞外域脫落，從而暫時(shí)升高血漿α-klotho蛋白濃度，而血α-klotho蛋白濃度的改變又進(jìn)一步影響竇房結(jié)功能。

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