不同方式的睡眠剝奪對大鼠學習記憶的影響

王博文，徐兆慧，杜 勇，陳 勝，劉芳娥

(第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學實驗中心，陜西西安 710032)

睡眠是維持機體生理活動和心理活動正常運行的重要保證。睡眠剝奪(sleep deprivation, SD)是指由于各種原因引起的機體睡眠量不足的狀態(tài)[1]。隨著社會節(jié)奏的加速、競爭壓力的加大、網絡的普及、持續(xù)性加班、不健康的生活方式等，致使越來越多的人處于不同程度的睡眠剝奪狀態(tài)，尤其是某些特殊職業(yè)，如醫(yī)務人員、執(zhí)勤人員、航空航海乘務人員，或在某些極端情況下，如災害救援、物資搶運、戰(zhàn)時狀態(tài)等，睡眠剝奪現(xiàn)象就會時常發(fā)生。睡眠可影響動物的行為和生理功能，如學習記憶和認知能力[2]。研究證實睡眠剝奪的大鼠學習記憶能力明顯下降[3-4]。睡眠剝奪對腦功能以及學習記憶的影響顯著，并且已經得到公認。因此，研究在不可避免的睡眠剝奪情況下，怎樣減少睡眠剝奪對腦功能以及學習記憶的影響，具有重要的現(xiàn)實意義。但是，目前鮮見這方面的研究報道。本實驗擬觀察不同的睡眠剝奪方式對大鼠學習記憶能力和行為的影響，為減少睡眠剝奪對腦功能以及學習記憶的影響提供實驗依據(jù)；同時檢測大鼠大腦皮層、海馬以及血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乙酰膽堿酯酶(TChE)的含量，探討其可能的發(fā)生機制。

1材料與方法

1.1實驗動物上海產Sprague Dawley大鼠24只，成年、雄性、健康，體質量(300±30)g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2藥品與儀器Morris水迷宮、曠場反應箱(成都泰盟科技有限公司)；SOD、MDA和TChE試劑盒(南京建成生物技術公司)；離心機，721型分光光度計，恒溫水浴鍋等。

1.3方法

1.3.1動物分組及不同方式睡眠剝奪模型的建立 將24只大鼠適應環(huán)境7 d后隨機分為4組，每組6只：空白組(不做任何處理，正常睡眠)，對照組(連續(xù)睡眠剝奪120 h)，實驗1組(睡眠剝奪共計120 h，分3次進行，每次40 h；間歇2次，每次10 h，共間歇20 h)，實驗2組(睡眠剝奪共計120 h，分6次進行，每次20 h；間歇5次，每次4 h，共間歇20 h)，見圖1。

1.3.2采用改良多平臺法建立大鼠的睡眠剝奪模型 睡眠剝奪箱中央放置4個高15 cm圓形平臺，直徑6 cm，平臺向中間凹陷，僅夠大鼠在平臺上站立。剝奪箱內注有水，水高5 cm，水溫保持恒定。大鼠進入睡眠時，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，又跳上平臺，造成睡眠剝奪?？瞻捉M大鼠平臺直徑15 cm，大鼠可以在平臺上睡眠，其余與實驗組環(huán)境相同。

圖1 各組大鼠不同睡眠剝奪方式模型的建立

1.3.3行為檢測 用曠場反應箱測試大鼠行為的變化，將曠場反應箱放置在一個較封閉的屋內。曠場反應箱為一個底部面積為100 cm×100 cm，高30 cm的方形容器，曠場正上方有一個攝像頭監(jiān)視大鼠活動，并可以將實驗數(shù)據(jù)和圖像信息輸入計算機。觀察大鼠在曠場反應箱中5 min內的運動。靜止總時間(total still time, TST)表示大鼠在曠場反應箱中5 min內靜止的總時間，運動總距離(total movement distance, TMD)表示大鼠在曠場反應箱中5 min內運動的總距離。中心逗留時間(center stay time, CET)表示大鼠在曠場反應箱中5 min內在內環(huán)的停留時間，角落逗留時間(corner stay time, COT)表示大鼠在曠場反應箱中5 min內在曠場四角的停留時間。內環(huán)是指以曠場中心點為圓心，以10 cm為半徑的圓。

1.3.4學習記憶能力的測試 用Morris水迷宮法進行大鼠學習記憶的訓練與測試，其主要測試大鼠的空間學習記憶能力。水迷宮為一直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，池內水深25 cm，水池按方位平均分為4個象限，設定4個入水點。在一個象限內置一個直徑7 cm、高23 cm的白色平臺，平臺沒于水面下2 cm。水溫保持在20 ℃左右。實驗過程中水池及周圍環(huán)境保持不變。實驗時，將大鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，用秒表記錄大鼠的逃避潛伏期[即從大鼠入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間(s)]，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s。若入水后60 s大鼠未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留10s，然后進行下一次實驗。將每只大鼠從4個入水點分別放入水池為1輪訓練，1輪訓練進行4次，訓練2輪，共訓練8次，每次60 s，2次訓練之間間隔30 s。訓練成功的標志是大鼠在60 s內能夠找到平臺，淘汰訓練未成功的大鼠。記錄每只大鼠逃避潛伏期(escape latency, EL)的時間。

行為檢測后對大鼠進行學習記憶的訓練，訓練成功后，即開始實驗監(jiān)測。實驗時，將大鼠面向池壁從4個入水點分別放入的逃避潛伏期(s)取均數(shù)，作為測試成績，若大鼠在60 s內未找到平臺，則以60 s計。

1.3.5血漿SOD和MDA的測定 各組大鼠在水迷宮測量后，立即用200 g/L的烏拉坦進行腹腔注射，每只大鼠2 mL。然后斷頭處死大鼠，取血5 mL(每毫升全血加肝素100 U)，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取血漿置于-20 ℃凍存待測。根據(jù)試劑盒的操作步驟，采用羥胺法檢測SOD活力，TBA法檢測MDA含量。

1.3.6海馬和大腦皮層內SOD、MDA和TChE的測定 于冰浴中取出海馬與大腦皮層，分析天平稱質量，按質量海馬和大腦皮層分別加冰冷的100 mmol/L PBS溶液(pH 7.0)稀釋至100 g/L，并以玻璃勻漿器勻漿，離心3 min(3 000 r/min)后沉淀，取上清液待測。根據(jù)試劑盒的操作步驟，采用羥胺法檢測SOD活力，TBA法檢測MDA含量，比色法檢測TChE含量。

2結果

2.1不同方式睡眠剝奪對大鼠行為興奮性、探索性和學習記憶能力的影響曠場反應測試結果顯示，對于TST、CET和COT，實驗組時間均較空白組長(P<0.01)，而較對照組短(P<0.01)，而且實驗2組較實驗1組時間短(P<0.01)；而對于TMD，實驗組較空白組短(P<0.01)，而較對照組長(P<0.01)，且實驗2組較實驗1組長(P<0.01)。

水迷宮中逃避潛伏期的測試，實驗組均較空白組延長(P<0.01)，而較對照組縮短(P<0.01)，而且實驗2組較實驗1組縮短(P<0.01，表1)。

表1 各組大鼠行為和學習記憶能力的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對照組比較，△P<0.01；與實驗1組比較，▲P<0.01，#P<0.05。

2.2不同方式睡眠剝奪大鼠血漿、海馬和大腦皮層內SOD和MDA含量的變化大鼠血漿、海馬和大腦皮層組織中SOD含量，實驗組較空白組低(P<0.01)，較對照組高(P<0.01)，而且實驗2組較實驗1組高(P<0.01，表2)；而血漿、海馬和大腦皮層組織中MDA含量，實驗組較空白組高(P<0.01)，較對照組低(P<0.01)，而且實驗2組較實驗1組低(P<0.01，表3)。

2.3不同方式睡眠剝奪大鼠海馬和大腦皮層內TChE含量的變化大鼠海馬和大腦皮層中TChE含量，實驗組較空白組高(P<0.01)，較對照組低(P<0.01)，而且實驗2組較實驗1組高(P<0.01，表4)。

表2 血漿、海馬和大腦皮層內SOD含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對照組比較，△P<0.01，▲P<0.05；與實驗1組比較，#P<0.01。

3討論

研究證明，睡眠剝奪對學習記憶有損傷作用[4-5]。我們希望通過構建不同方式睡眠剝奪的大鼠模型來研究在不可避免的睡眠剝奪情況下，怎樣減少睡眠剝奪對腦功能以及學習記憶的影響，提高工作和學習效率。因此，本實驗設計2個實驗組給予不同的間斷性睡眠剝奪方式，并且設計一個空白組和一個完全睡眠剝奪的對照組，以此來模擬現(xiàn)實情況，并且每組大鼠睡眠剝奪總時間一樣，間斷總時間也一樣，增加了每組之間的可比性。

表3 血漿、海馬和大腦皮層內MDA含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；對照組比較，△P<0.01；與實驗1組比較，▲P<0.01。

表4 海馬和大腦皮層內TChE含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對照組比較，△P<0.01；與實驗1組較，▲P<0.01。

曠場實驗中用靜止總時間和運動總距離指標考察大鼠的興奮性狀態(tài)。大鼠在曠場反應箱中，由于環(huán)境陌生，基本上處于運動狀態(tài)[6]。本研究結果顯示，睡眠剝奪期間的間歇次數(shù)多，一次性間歇時間短的大鼠相比而言，運動能力較強，說明間歇次數(shù)多的大鼠運動減弱程度低。實驗用中心逗留時間和角落逗留時間兩個指標考察大鼠的探索性行為，動物在情緒興奮時，更容易向空曠的地方進行探索。因此，在曠場中間逗留時間較長，反之則會在角落逗留時間較長[7]。在水迷宮實驗中用逃避潛伏期來考察大鼠的學習記憶能力[8]，學習記憶能力強的大鼠逃避潛伏期短[9]。本實驗結果顯示，間歇次數(shù)多、每次間歇時間短的大鼠，學習記憶能力和興奮性較強，逃避潛伏期短，說明睡眠剝奪總時間雖然一樣，但是有間歇的大鼠學習記憶能力明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對照組減弱程度稍低；間歇總時間一樣，但是間歇次數(shù)越多，大鼠學習記憶能力的減弱程度就越低。

SOD是重要的金屬酶，為機體直接清除自由基的重要酶類，通過歧化反應清除H2O2和OH·的前身O2，從而保護細胞免受毒性氧自由基的損壞[10]。睡眠剝奪后腦組織SOD活性降低，提示腦內氧自由基的含量升高，由此推測氧自由基增加及被清除能力減弱可能是睡眠剝奪后腦功能損害、學習記憶能力下降的重要原因之一[11]。MDA是脂質過氧化物的分解產物，為一種重要的生物大分子交聯(lián)劑，它能交聯(lián)蛋白質與核酸，使DNA發(fā)生突變，影響信息傳遞、轉錄和復制，導致蛋白質合成能力下降或合成蛋白質功能紊亂，從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降，故其含量間接地反映了自由基的損害程度[12-14]。睡眠期間的很多神經遞質影響學習記憶，乙酰膽堿(ACh)就是其中之一。TChE是腦內與學習記憶相關的重要酶類之一，可分解突觸間隙的神經遞質乙酰膽堿，使乙酰膽堿含量降低；TChE活性增加會導致腦內學習記憶活動障礙[14]。通過測量TChE含量可以間接反應大鼠大腦中ACh含量。實驗結果表明，睡眠剝奪間歇次數(shù)多、一次性間歇時間短的大鼠SOD含量較高，MDA和TChE含量較低；睡眠剝奪總時間雖然一樣，但是有間歇的大鼠SOD含量明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對照組減少程度低，MDA和TChE含量明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對照組增高程度低；間歇總時間一樣，但是間歇次數(shù)越多，大鼠SOD含量越高，MDA和TChE含量越低，大鼠大腦功能損傷較輕，學習記憶能力越強，進一步驗證了行為學實驗的結果。

總之，與睡眠剝奪間歇次數(shù)多的大鼠相比，間歇次數(shù)少的大鼠行為興奮性和學習記憶能力較強；同時，大鼠血漿、海馬和大腦皮層內MDA、TChE含量較低， SOD的活性較高。說明間斷性睡眠剝奪增強大鼠抗自由基和抗過氧化損傷能力，減少大鼠大腦內ACh的含量降低可能是增強學習記憶能力的重要機制之一。因此，在一些由于緊急情況而不可避免造成睡眠剝奪的情況下，盡可能安排多次少量的間歇休息時間，以減少睡眠剝奪對機體學習記憶和行為的影響，提高工作效率。

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