金錢魚腦型芳香化酶基因cDNA的克隆及表達(dá)分析

張敏智,李廣麗,朱春華,鄧思平

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江,524088)

金錢魚(Scatophagus argue Linnaeus)又名金鼓魚,隸屬鱸形目 (Perciformes)金錢魚科(Scatophagidae),金錢魚屬(Scatophagus)。國(guó)際上金錢魚科僅金錢魚1屬 3 種,為廣鹽性亞熱帶魚類,廣泛分布于印度-太平洋水域[1],中國(guó)東南沿海及北部灣均有分布,其中在廣東、臺(tái)灣及廣西沿岸為常見的魚類。目前,金錢魚大部分養(yǎng)殖種苗仍然來自野生資源,數(shù)量有限且呈逐年減少之勢(shì),市場(chǎng)對(duì)人工種苗的需求量逐漸增大。但人工繁育過程中金錢魚卵巢不能充分成熟,且雄性性成熟早于雌性[2],為人工繁殖金錢魚帶來困難。因此,人工誘導(dǎo)金錢魚卵巢發(fā)育是解決金錢魚大批量苗種生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。

在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,芳香化酶由 Cyp19單基因編碼,但在硬骨魚類中卻發(fā)現(xiàn)了兩種芳香化酶基因,即腦型芳香化酶(Cyp19a1b)和性腺型芳香化酶(Cyp19a1a),分別以明顯不同的形式存在于腦和性腺中[3-4]。研究表明,芳香化酶可影響哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能,調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和繁殖功能[5]。有報(bào)道指出[6]芳香化酶與性取向有關(guān),若雌性先熟則芳香化酶的表達(dá)量減少,而雄性先熟則表達(dá)量增加。此外,芳香化酶的表達(dá)及其酶活性可受性類固醇激素和促性腺激素等的調(diào)控[7],也受到溫度等環(huán)境因素的控制和調(diào)節(jié)[8]。研究發(fā)現(xiàn), 性類固醇激素(E2)先與芳香化酶神經(jīng)樣細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合,而后激發(fā)芳香化酶基因的表達(dá)[9-10]。Carlos[11]證實(shí),促性腺激素中卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)是調(diào)節(jié)芳香化酶活性的重要因子。FSH可誘導(dǎo)產(chǎn)生芳香化酶,而 LH通過增加胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度活化蛋白激酶 C(PKC),PKC的活化則會(huì)阻礙FSH誘導(dǎo)產(chǎn)生芳香化酶。溫度對(duì)魚類性腺發(fā)育成熟過程的效應(yīng)則有以下幾點(diǎn): (1)直接影響一些酶和激素的活性,進(jìn)而影響性腺的發(fā)育;(2)影響性腺對(duì)促性腺激素(GtH)的敏感性;(3)影響腦垂體對(duì) GtH的合成及分泌。在尖紋鱸(Lates calcarifer)[12]和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[13]等的研究中都表明高溫將抑制Cyp19a1b基因的表達(dá)。然而,迄今為止,有關(guān)魚油對(duì)芳香化酶Cyp19的影響,以及溫度和飼料中魚油含量對(duì)金錢魚卵巢發(fā)育相關(guān)基因的研究尚未見報(bào)道。

本研究采用 RT-PCR和 RACE法,克隆金錢魚Cyp19a1b的cDNA全長(zhǎng),并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了溫度和魚油處理后雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá),旨在探討 Cyp19a1b基因表達(dá)與溫度及魚油添加量的相互關(guān)系,為金錢魚人工繁育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

基因克隆所用金錢魚購(gòu)自湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng),為雌性性成熟個(gè)體;溫度和魚油處理實(shí)驗(yàn)所用魚均購(gòu)自于廣東省珠海市龍勝魚苗培育基地,為二齡雌性金錢魚(體質(zhì)量: (316.3±70.3)g,體長(zhǎng):(21.4±2.0)cm),晝夜充氧,水體鹽度為 10±2,自然光照,每日傍晚投喂1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物

簡(jiǎn)并引物P1和P2根據(jù)GenBank中已有魚類腦型芳香化酶Cyp19a1b保守序列設(shè)計(jì);特異性引物P3和 P4根據(jù)獲得的 Cyp19a1b基因保守區(qū)片段設(shè)計(jì),以檢測(cè)溫度和魚油對(duì)雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響;根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)特異性引物BGSP1、NBGSP1和 BGSP2,其中 BGSP1、NBGSP1通過巢式PCR來擴(kuò)增Cyp19a1b cDNA的5′末端,而BGSP2 用來擴(kuò)增其 3′末端;β-actinF 和 β-actinR 作為內(nèi)參引物擴(kuò)增金錢魚的 β-actin基因,以校正Cyp19a1b mRNA的相對(duì)表達(dá)量,所有引物見表 1,均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 金錢魚Cyp19a1b cDNA的擴(kuò)增與克隆

取雌性金錢魚腦垂體,抽提總 RNA,實(shí)驗(yàn)流程參照Trizol Reagent (Invitrogen)說明書操作。取2 μg總RNA按照M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)合成cDNA第一鏈,以簡(jiǎn)并引物(P1和P2)擴(kuò)增金錢魚 Cyp19a1b 基因保守區(qū)片段。采用SMARTer RACE試劑盒(Clontech)克隆金錢魚Cyp19a1b cDNA 3′末端和5′末端序列,按照SMARTer RACE試劑盒說明操作進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物于 1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,切下目的條帶,用DC3511瓊脂糖DNA膠回收試劑盒(Biomiga)純化PCR產(chǎn)物。再將純化的產(chǎn)物與載體pMD-19T按9︰1的比例進(jìn)行連接反應(yīng)。最后取連接產(chǎn)物 10 μL用于轉(zhuǎn)化到DH5α中,進(jìn)而恒溫培養(yǎng)、陽(yáng)性克隆以及測(cè)序,測(cè)序在上海生工生物工程公司完成。

1.2.3 序列分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

應(yīng)用 DNAMAN 5.0將測(cè)序所得保守區(qū)片段序列、5′端序列及3′端序列進(jìn)行拼接,并推導(dǎo)氨基酸序列。將獲得的 cDNA序列與 GenBank中已有魚類Cyp19a1 cDNA序列進(jìn)行相似性檢索比對(duì),應(yīng)用CLUSTAL W將推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已有魚類的 Cyp19a1氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。采用SignalP4.1server(http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預(yù)測(cè)金錢魚Cyp19a1b蛋白序列的信號(hào)肽。利用 MEGA5.0鄰位相聯(lián)法(Neighbor-joining),重復(fù)1000次,gap處理為缺失,基于Cyp19a1氨基酸序列構(gòu)建各物種系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 克隆金錢魚Cyp19a1b cDNA序列及檢測(cè)表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used for cloning and expression analysis of Cyp19a1b in S.argus

1.2.4 溫度和魚油對(duì)金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響

溫度處理和魚油處理實(shí)驗(yàn)均分為 3組,其中因金錢魚適宜生長(zhǎng)溫度范圍為 20～28℃,故溫度處理實(shí)驗(yàn)魚分別飼養(yǎng)在水溫為 23、26和 29℃(加熱棒控制)的塑料桶(500 L)中,各溫度組溫差范圍控制在±1℃(溫度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè));魚油處理實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)在(1 m×1 m×2 m)的網(wǎng)箱中,分別投喂含0、2%和6%魚油的海水魚配制飼料(根據(jù)海水魚配制飼料配方進(jìn)行配制)。溫度處理(3周和6周)、魚油投喂處理(4周和8周)以及實(shí)驗(yàn)前(0周)時(shí),每組隨機(jī)取3尾魚腦垂體組織,分別抽提總RNA。取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA 第一鏈。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 0.8 μL,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Cyp19a1b mRNA的表達(dá),實(shí)驗(yàn)流程參照熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定試劑盒(BioRad)操作說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 2ΔCt法計(jì)算Cyp19a1b和β-actin在金錢魚腦垂體組織在溫度和魚油處理過程的表達(dá)量;采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,當(dāng) P＜0.05時(shí)視為差異顯著;并采用Duncan’s方法進(jìn)行多重比較分析,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(± S.E.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢魚Cyp19a1b基因全長(zhǎng) cDNA克隆

通過3個(gè)有重疊部分的PCR片段拼接獲得金錢魚Cyp19a1b cDNA全長(zhǎng)。其中中間片段以雌性金錢魚腦垂體中抽提的總 RNA為模板,利用 Cyp19a1b高度保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物P1和P2進(jìn)行擴(kuò)增,得到大小為 464bp的預(yù)期片段;利用特異性引物BGSP2和BGSP1、NBGSP1進(jìn)行SMART-RACE-PCR,分別獲得3′末端1249 bp及5′末端1187bp的預(yù)期條帶,拼接后得到金錢魚Cyp19a1b cDNA全長(zhǎng)(登錄號(hào):JX841314)。金錢魚Cyp19a1b cDNA 序列由2409個(gè)核苷酸組成,其開放閱讀框(ORF)包含 1506 bp,編碼 501個(gè)氨基酸,5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)有 164bp,3′-UTR(不包括 poly(A))有 712 bp(圖 1),推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為 56.697kDa。利用 SignalP對(duì)金錢魚Cyp19a1b蛋白序列序列在線搜索,尋找信號(hào)肽序列,發(fā)現(xiàn)該蛋白存在信號(hào)肽的概率極低,不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn),是一種非分泌蛋白。

2.2 序列分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

金錢魚Cyp19a1b cDNA序列與GenBank中已有魚類 Cyp19a1 cDNA序列相似性檢索比對(duì)顯示,所獲得序列與魚類 Cyp19a1b cDNA序列的同源性為70%～87%,與Cyp19a1a同源性低于56%。氨基酸序列比對(duì)顯示,金錢魚 Cyp19a1b與黃錫鯛(Rhabdosargus sarba)和舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)Cyp19a1b同源性較高,分別為86.2%、86.5%。與鯉魚(Cyprinus carpio)、稀有 鯽(Gobiocypris rarus)、斑馬魚(Danio rerio)、赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)、大黃魚(Larimichthys crocea)、南方大口鯰(S.meridionalis)和鯔魚(Mugil cephalus)Cyp19a1b 同源性為64.1%～84.4%,而與上述7種魚Cyp19a1a 同源性低于 63.5%。與本實(shí)驗(yàn)室研究的胡子鲇(Clarias fuscus)Cyp19a1b同源性也達(dá)到了70.8%。此外,金錢魚Cyp19a1b與人和家鼠腦型芳香化酶的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),分別僅為52%和50.8%的同源性。與其他脊椎動(dòng)物芳香化酶相似,金錢魚Cyp19a1b也包含 I－螺旋區(qū)(I-helix region)、芳香化酶特異保守區(qū)Ⅱ(aromatase specific substrate binding region)和血紅素結(jié)合區(qū)Ⅲ(heme-binding region)(圖 2)。

摘錄Genebank中大黃魚Cyp19a1b(ACO350-42.1)、大黃魚 Cyp19a1a (ACO35041.1)、斑馬魚 Cyp19a1b(AAK00642.1)、斑馬魚 Cyp19a1a (AAG-12243.1)、鯉魚 Cyp19a1b (ACC95443.1)、鯉魚 Cyp19a1a(ACB13197.1)、赤點(diǎn)石斑魚 Cyp19a1b(A-AS58447.1)、赤點(diǎn)石斑魚Cyp19a1a (AAS58448.1)、稀有 鯽Cyp19a1b(ADB44882.1)、稀有 鯽 Cyp19a1a(ADB29065.1)、舌齒鱸 Cyp19a1b(AAM-95455.1)、黃錫鯛 Cyp19a-1b(ABC70868.1)、細(xì)棘海豬魚(Halichoeres tenuispinis)Cyp19a1a(AAR3704-8.1)和鯔魚 Cyp19a1a(AAW7-2732.1)、胡子鲇Cyp19a1b (AFB77217.1)、南方大口鲇Cyp19a1a (AAP83133.1)的氨基酸序列構(gòu)建氨基酸進(jìn)化樹,結(jié)果顯示: 所有魚類 Cyp19a1b聚為一類,而Cyp19a1a則聚為另一類。金錢魚Cyp19a1b與黃錫鯛 Cyp19a1b同處于 Cyp19a1b一支,與大黃魚、舌齒鱸和赤點(diǎn)石斑魚Cyp19a1b同處于Cyp19a1b一大支,均屬鱸形目不同亞目,而與斑馬魚、鯉魚、稀有 鯽和胡子鲇 Cyp19a1b處于不同級(jí)不同分支,表明金錢魚與黃錫鯛親緣關(guān)系最近,與鯉形目中斑馬魚、鯉魚、稀有鯽以及鲇形目的胡子鲇親緣關(guān)系最遠(yuǎn),分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和生化特征分類的結(jié)果相一致(圖3)。

圖1 金錢魚Cyp19a1b全長(zhǎng)cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and predicted amino-acid sequences of Cyp19a1b in S.argus

圖2 金錢魚腦型芳香化酶與其他脊椎動(dòng)物芳香化酶部分氨基酸序列的比較Fig.2 Alignment of S.argus Cyp19a1b partial amino acid sequence and those of other species

2.3 溫度對(duì)雌性金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響

隨處理時(shí)間的延長(zhǎng),26℃和29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量都逐漸降低,但29℃組顯著低于26℃組(P＜0.05)。此外,23℃組表達(dá)量先減小后增加,且在 6周時(shí)顯著高于 26℃和 29℃組(P＜0.05),其表達(dá)量大約為26℃組2倍(圖4)。

2.4 魚油含量對(duì)雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響

隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng),3個(gè)魚油投喂組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量均逐漸降低,魚油對(duì)金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量無顯著影響(P ＞0.05)(圖 5)。

3 討論

圖3 基于NJ法構(gòu)建的金錢魚Cyp19a1b和其他魚類的Cyp19a1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cyp19a1b in S.argus and Cyp19a1 in other fish based on NJ method

圖4 溫度對(duì)雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響(n=3)Fig.4 Effects of temperature on pituitary Cyp19a1b mRNA expression in female S.argus (n=3)

圖5 魚油對(duì)雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)的影響(n=3)Fig.5 Effects of fish oil on pituitary Cyp19a1b mRNA expression in female S.argus (n=3)

芳香化酶(Cyp19a1)研究的代表類群從文昌魚(Branchiostoma)到人,表明Cyp19a1是一個(gè)在進(jìn)化上起源早于脊椎動(dòng)物的保守基因[14]。目前,在魚類[15,16]、鳥類[17]、嚙齒動(dòng)物[18]和哺乳動(dòng)物[19]的Cyp19a1 cDNA都已成功被克隆。本研究從金錢魚腦垂體中成功克隆了腦型芳香化酶基因 Cyp19a1b,通過氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知,金錢魚 Cyp19a1b與其他魚類的Cyp19a1b同源性較高且聚為一支,與其他魚類的性腺型芳香化酶基因 Cyp19a1a 同源性較低。因此,所獲得的金錢魚 Cyp19a1屬于魚類Cyp19a1b,與同為鱸形目的黃錫鯛同源性最高,親緣關(guān)系最近,與鯉形目(Cypriniformes)中斑馬魚、鯉魚、稀有 鯽以及鲇形目(Siluriformes)的胡子鲇親緣關(guān)系最遠(yuǎn),分析結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和生化特征分類的結(jié)果相一致。

在真核生物中,芳香化酶作為 1種膜結(jié)合蛋白,決定其定位在線粒體上還是內(nèi)膜系統(tǒng)中,主要依賴于 N端信號(hào)序列。本研究中,通過在線對(duì)金錢魚腦型芳香化酶信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),該蛋白存在信號(hào)肽的概率極低,不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn),為非分泌型蛋白,可將其定位于線粒體內(nèi)膜上。芳香化酶主要功能除了決定性別分化的方向外,對(duì)性腺發(fā)育也有顯著影響[5,20]。有報(bào)道指出,腦芳香化酶可能參與腦－腦垂體－性腺軸的繁殖生理活動(dòng)[21]。

大量研究表明,Cyp19a1b在硬骨魚腦垂體中有較高的表達(dá)量,如胡子鲇[22]、虹鱒[23](Oncorhynchus mykisss)和歐洲舌齒鱸[24](Dicent rarchus labrax)等。因此,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)溫度和魚油處理后Cyp19a1b mRNA在腦垂體的表達(dá),進(jìn)而探討溫度和魚油添加量與Cyp19a1b的關(guān)系。目前,關(guān)于溫度對(duì)性腺型芳香化酶的報(bào)道較多,而對(duì)腦型芳香化酶的報(bào)道較少。在半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[13]和羅非魚(Oreochromis mossambicus)[25]的研究中都表明,溫度過高將會(huì)抑制 Cyp19a1b mRNA的表達(dá)。最新研究也表明,水溫高于 28℃時(shí)尖紋鱸 (Lates calcarifer)腦中的芳香化酶活性將逐漸降低,而血漿中的 E2含量卻逐漸升高[12],可能 E2增加反饋抑制了芳香化酶活性[26]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),水溫26℃和29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量均逐漸降低,與本實(shí)驗(yàn)室6周E2的研究結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(E2結(jié)果另文發(fā)表),可能是 E2增加對(duì)其的反饋抑制效應(yīng)所致。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束(6周)時(shí),29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達(dá)量顯著低于26℃組,表明高溫抑制金錢魚Cyp19a1b mRNA的表達(dá),與前人研究結(jié)論一致;23℃組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量在3周急劇降低,但實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)又上升,這種現(xiàn)象在卵巢發(fā)育的過程中不能用E2反饋調(diào)節(jié)抑制來說明,其中的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

魚油中因富含 n-3多不飽和脂肪酸(PUFA),尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),在全球水產(chǎn)飼料中被大規(guī)模利用。而 EPA和 DHA與雌二醇(E2)密切相關(guān)[27],因此,魚油對(duì)魚類特別是海水魚類的正常繁殖、生長(zhǎng)和發(fā)育都起著非常重要的作用,是其生命過程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)因子[28]。研究表明,魚油中的PUFA可以誘導(dǎo)E2的增加,從而促進(jìn)虹鱒[29]和黑鱸(Dicentrarchus labrax L.)[30]卵巢的發(fā)育。而E2是在芳香化酶Cyp19的催化作用下才能合成,因此,魚油中的PUFA可能會(huì)促進(jìn)芳香化酶Cyp19基因的表達(dá)。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng),3個(gè)魚油投喂組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量均逐漸降低,與本實(shí)驗(yàn)室8周E2的研究結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(E2結(jié)果另文發(fā)表),因此,可能亦是由于 E2增加對(duì)其的反饋抑制調(diào)節(jié)所致。與此同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)魚油含量對(duì)金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)雖無顯著影響,但 8周時(shí),腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量依次為: 對(duì)照組＞2%魚油組＞6%魚油組,與 E2關(guān)系相反,表明金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量隨魚油含量的增加而逐漸降低;魚油可誘導(dǎo) E2水平不斷積累,當(dāng)E2水平增加到一定水平將可能反饋抑制調(diào)節(jié)金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達(dá)。

綜上所述,隨著卵巢發(fā)育或魚油含量的提高,可降低雌性金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達(dá),這種降低可能是 E2反饋調(diào)節(jié)所致;水溫高于26℃將抑制Cyp19a1b mRNA的表達(dá)。

[1]Barry T P,Castanos M T ,Fast A W,et al.Gonadal maturation and spawning induction in female spotted scat (Scatophagus argus)[J].Journal of Aquaculture in the Tropics,1993,8: 121-130.

[2]蘭國(guó)寶,閻冰,廖思明,等.金錢魚生物學(xué)研究及回顧[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(7): 39-41.

[3]Dalla V L,Ramina A,Vianello S,et al.Cloning of two mRNA variants of brain aromatase cytochrome P450 in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum)[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2002,82: 19-32.

[4]Greytak S R,Callard G V.Aromatase in fish: History and future perspectives [J].Comparative Biochemistry and Physiology,2007,148 (Part A): S27-S28.

[5]Lephart E D.A review of brain aromatase cytochrome P450 [J].Brain Research Reviews,1996,22 (1): 1-26.

[6]Carreau P,Mercedes B.Aromatase distribution and regulation in fish [J].Fish Physiology and Biochemistry,2005,31: 215-226.

[7]洪萬樹,方永強(qiáng).魚類芳香化酶活性研究的進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,24(3): 285-288.

[8]王慧,李霞,張育輝.CYP19基因表達(dá)與芳香化酶活性調(diào)控因子的研究進(jìn)展[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2010,19(3): 304-308.

[9]翁幼竹,張為民,方永強(qiáng),等.17β-雌二醇誘導(dǎo)鯔魚雌性化的機(jī)制: 芳香化酶和雌激素受體雙染定位研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2003,10(6): 446-449.

[10]Mélanie V,Yann L P,Bon-chu C,et al.17a-Ethinylestradiol disrupts the ontogeny of the forebrain GnRH system and the expression of brain aromatase during early development of zebrafish [J].Aquatic Toxicology,2010,99: 479-491.

[11]Carlos S.Aromatase expression in the ovary: Hormonal and molecular regulation [J].Steroids,2008,73:473-487.

[12]Saman A,Trevor A,Rockyde N.Effect of rearing water temperature on protandrous sex inversion in cultured Asian Seabass (Lates calcarifer)[J].General and Comparative Endocrinology,2012,175: 416-423.

[13]鄧思平,陳松林,劉本偉,等.半滑舌鰨腦芳香化酶基因 cDNA克隆及表達(dá)分析[J].動(dòng)物學(xué)研究,2008,29 (1): 17-24.

[14]Callard G V,Tchoudakova A.Evolutionary and functional signification of two CYP19 genes differentially expressed in brain and ovary of goldfish[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,1997,61(3-6): 387-392.

[15]Leea Y M,Williamsb T D,Junga S O,et al.cDNA cloning and expression of a cytochrome P450 1A(CYP1A)gene from the hermaphroditic fish Rivulus marmoratus [J].Marine Pollution Bulletin,2005,51:769-775.

[16]Halm S,Kwon J Y,Rand-Weaver M,et al.Cloning and geneexpression of P450 17alpha-hydroxylase,17,20-lyase cDNA in the gonads and brain of the fathead minnow Pimephales promelas [J].General and Comparative Endocrinology,2003,130(3): 256-266.

[17]Silverrin B,Ballien M,Foidart A,et al.Distribution of aromatase activity in the brain and peripheral tissues of passerine and nonpasserine avian species [J].General and Comparative Endocrinology,2000,117 (1): 34-53.

[18]Serdar E B,Siby S,Kazuto T,et al.Cloning and characterization of the rat cytochrome P450 4F5(CYP4F5)gene [J].Gene,2002,297: 179-187.

[19]Bulun S E,Sebastian S,Takayama K,et al.The human CYP19 (aromatase P450)gene: update on physiologic roles and genomic organization of promoters [J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2003,86: 219-224.

[20]文愛韻,尤鋒,孫鵬,等.牙鲆 dmrt1基因的克隆及其與 P450arom 基因的組織表達(dá)分析[J].海洋科學(xué),2010,34(11): 97-102.

[21]Cavaco J E,Baal J,Dijk W,et al.Steroid hormones stimulate gonadotrophs in juvenile male African catfish(Clarias gariepinus)[J].Biology Reproduction,2001,64: 1358-1365.

[22]孫晶,李廣麗,朱春華,等.腦型芳香化酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆及表達(dá)[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2012,19(3):408-415.

[23]Valle L D ,Ramina A,Vianello S,et al.Cloning of two mRNA variants of brain aromatase cytochrome P-450 in rainbow trout Oncorhynchus mykisss Walbaum[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2002,82: 19-32.

[24]Alicia G,Francesc P.Aromatase activity in the European sea bass (Dicentrarchus labrax)brain.Distribution and changes in relation to age,sex,and the annual reproductive cycle [J].General and Comparative Endocrinology,2003,132: 223-230.

[25]Tsai C L,Wang L H,Chang C F,et al.Effects of gonadal steroids on brain serotonergic and aromatase activity during the critical period of sexual differentiation in tilapia,Oreochromis mossambicus[J].Journal of Neuroendocrinol,2000,12: 894-898.

[26]Kishida M,Callard G.Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Denio rerio)brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development [J].Endocrinology,2001,142: 740-749.

[27]Tacon A G J,Metian M.Global overview on the use of fish meal and fish oil in industrially compounded aquafeeds: trends and future prospects [J].Aquaculture,2008,285: 146-158.

[28]許友卿,莊麗,丁兆坤.多不飽和脂肪酸對(duì)海水仔稚魚生長(zhǎng)發(fā)育的影響及機(jī)理[J].飼料工業(yè),2010,31(14):13-18.

[29]Fremont L,Leger C,Petridou B,et al.Effects of a n-3 polyunsaturated fatty acid-deficient diet on profiles of serum vitellogenin and lipoprotein in vitellogenic trout(Salmo gairdneri)[J].Lipids,1984,19: 522-528.

[30]Jose M N,Evaristo M,Mark T,et al.Effect of dietary lipid composition on vitellogenin,17β-estradiol and gonadotropin plasma levels and spawning performance in captive sea bass (Dicentrarchus labrax L.)[J].Aquaculture,1998,165: 65-79.