籃子魚內(nèi)臟粗提液制備長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體的初步研究

李俊鵬 ,劉建國龐 通李 虎

(1.中國科學院 海洋研究所 生物工程中心,山東 青島 266071;2.中國科學院大學,北京 100049)

卡帕藻屬和麒麟菜屬紅藻,其富含紅藻多糖卡拉膠,一直是生產(chǎn)卡拉膠的主要原料[1-3]?？ɡz因其具有良好的凝膠性、保水性、增稠性和助懸性,在食品和化工中有著廣泛的應用[4-6],研究表明,麒麟菜類海藻還具有工業(yè)生產(chǎn)乙醇的潛質(zhì)[7-10],此類產(chǎn)卡拉膠紅藻資源具有巨大開發(fā)價值。目前我國產(chǎn)卡拉膠紅藻的養(yǎng)殖規(guī)模相對較小[2-3,11],這與麒麟菜在20～30℃下生長有關(guān)[1,12-14],導致養(yǎng)殖區(qū)域受到限制,另外,其長期營養(yǎng)繁殖造成種質(zhì)退化,產(chǎn)量和質(zhì)量均下降,敵害、病害頻發(fā)[2]。因此,需要篩選和培育生長速率高、膠含量和質(zhì)量好、抗病力強、耐低溫的麒麟菜,應對日益增長的養(yǎng)殖需要。

盡管麒麟菜理論上具有無性生殖和有性生殖世代,但通常難以獲得孢子和配子[2,15-16],通過有性生殖方式進行種苗繁育效率低,難度很大。運用細胞工程技術(shù),進行麒麟菜的種苗繁育可以拓展拓寬新的途徑。而原生質(zhì)體的獲得是進行細胞工程繁育,細胞融合等的重要前提,也為定向改良提供技術(shù)支撐。20世紀80年代,有關(guān)海藻原生質(zhì)體研究有很多報道[17-22],但因諸多條件的限制,所制備原生質(zhì)體效率都不高,大多未能用于海藻繁育的實際應用。近年來,Reedy[23]和 Yeong[24]分別制備出紫菜和江蘺的原生質(zhì)體。Cheney[25]利用孢子制得原生質(zhì)體,并通過細胞融合的方法獲得了麒麟菜細胞融合體,獲得了生長速率高的融合體植株。這為通過麒麟菜原生質(zhì)體,進行遺傳選育,獲得目標株系提供借鑒。制備海藻原生質(zhì)體,采用合適的酶是最關(guān)鍵的一環(huán),Zablakis等[26]利用纖維素酶和卡拉膠酶混合酶液,酶解制備長心卡帕藻原生質(zhì)體,但所用卡拉膠酶在很多國家均難以獲得。Salvador等[27]通過鮑魚內(nèi)臟提取液獲得長心卡帕藻原生質(zhì)體,觀察到細胞壁再生,但該方法在不同長心卡帕藻株系原生質(zhì)體制備中的使用效果不一,差別很大。

本文采用熱帶海域廣泛分布的雜食性籃子魚為材料,從籃子魚內(nèi)臟提取制備酶液,用于麒麟菜原生質(zhì)體的分離,為后期的麒麟菜組織培養(yǎng)及細胞工程育種打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗采用 2種紅藻,棕黑色長心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii),紅褐色細齒麒麟菜(Eucheuma denticulatum),上述海藻材料取自中國科學院海洋研究所海南陵水熱帶產(chǎn)卡拉膠海藻實驗基地(18°27′N,110°5′E);籃子魚(Siganus fuscessens)采于海南省陵水黎族自治縣黎安港灣,置于網(wǎng)箱中暫養(yǎng),每天用長心卡帕藻和細齒麒麟菜喂養(yǎng),籃子魚在飼喂 1周后,用于粗酶液的制備。

1.2 原生質(zhì)體制備

1.2.1 粗酶解液的制備

取長心卡帕藻和細齒麒麟菜喂養(yǎng)籃子魚5～10只,飼喂 1周后取其胃和肝臟放入 4℃預冷的小燒杯中,按每克內(nèi)臟加50 mmol/L pH為6.0的磷酸鈉鹽緩沖液20 mL,利用組織研磨器,充分研磨成漿。研磨后的勻漿分別用20、8和1 μm孔徑的濾紙分級過濾。向過濾后的濾液中添加0.6 mol/L甘露醇和5 mmol/L氯化鈣,冰浴保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 材料準備

取生長狀態(tài)良好的上述紅藻,先用海水沖洗干凈,再用消毒海水反復洗滌多次,再用無菌紙巾吸干并轉(zhuǎn)入消毒液(100 mg氯霉素 + 200 mL無菌海水)中處理0.5～1.0 h。稱取10 g經(jīng)過上述消毒的藻段,置于多功能料理機(九陽 JYL-CO20)中并加入 100 mL無菌海水,連續(xù)攪拌2次,每次1 min,以打碎藻段,靜止5 min后,棄去上清液(約100 mL),剩余底層的藻泥(約10 g)作為進一步酶解的材料,待用。

1.2.3 酶解與原生質(zhì)體純化

取制取的上述酶液和藻泥按設定的比例(詳見1.2.4)加入10 mL的離心管中混勻,然后置于搖床(國華 ZD-85)上震蕩酶解,震蕩速度100 r/min,分別開展了不同酶解條件(詳見 1.2.4)下的酶解實驗,以每只上述離心管為一個單位酶反應體系。

酶解結(jié)束前,向酶解液中加入3 mL洗脫液,然后放回搖床繼續(xù)酶解1 h,選用500 μm的篩絹過濾酶解液,將濾液轉(zhuǎn)入離心管中,在相對離心力為218 g(湘儀 TGL-16M)的條件下離心5 min;吸取離心管中最上層的清液5 mL,并加入5 mL洗脫液(高壓蒸汽滅菌過的含有0.6 mol/L甘露醇和5 mmol/L氯化鈣PES培養(yǎng)基)混勻,在218 g離心力條件下離心5 min,棄上清,向離心管中加入1 mL洗脫液,然后轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中。

1.2.4 酶解條件梯度實驗設計

實驗設置3個酶解濃度組合。酶濃度Ⅰ,0.1 g藻泥加3 mL酶液;酶濃度Ⅱ,0.2 g藻泥加3 mL酶液;酶濃度Ⅲ,0.4 g藻泥加3 mL酶液。酶解溫度25℃,酶解pH 6.0,酶液制備和酶解方法同前文所述,分別研究酶解(12,24,48 h)時,不同酶解濃度組合對其原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率的影響。

酶解溫度實驗設置3個梯度,分別為20,25和30℃,按照0.1 g藻泥加3 mL酶液的比例進行酶解,酶液制備和酶解方法如前文所述,酶解pH 6.0,期間利用搖床連續(xù)搖動,分別記錄12,24和48 h時溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率的作用效果。

酶解pH實驗設置3個梯度,分別為6.0,7.0和8.0,酶濃度選取0.1 g藻泥加3 mL酶液的比例,酶解溫度25℃,分別記錄酶解12,24和48 h時,不同pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率的作用效果。

1.2.5 原生質(zhì)體制備效果鑒定

1)原生質(zhì)體去壁程度: 用蒸餾水處理待檢樣品,在顯徽鏡下觀察細胞大小的變化,細胞膨脹均勻,破碎后無細胞壁殘余,表明所制備的原生質(zhì)體良好;若細胞單方向外漲至破碎,且脹碎后存在一定的細胞壁殘余,表明所制備的原生質(zhì)體尚有細胞壁存在,原生質(zhì)體制備不完全;若細胞不發(fā)生膨脹,細胞體積沒有變化,表明細胞壁依然完整,原生質(zhì)體制備不成功。

2)原生質(zhì)體完整性檢測: 向制備的原生質(zhì)體中加入 0.5%伊文思藍染液染色,在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體色澤,并利用細胞計數(shù)板計數(shù),統(tǒng)計獲得原生質(zhì)體數(shù)目,其中細胞深色的為原生質(zhì)體已經(jīng)破損,顏色較淺的為完好的原生質(zhì)體。

1.2.6 原生質(zhì)體產(chǎn)量產(chǎn)率統(tǒng)計

原生質(zhì)體產(chǎn)量監(jiān)測用顯微鏡計數(shù)法,先以血球計數(shù)板計算出每毫升酶解液中原生質(zhì)體數(shù)量,然后折算單位酶反應體系所獲得的原生質(zhì)體的總數(shù)目;原生質(zhì)體產(chǎn)率為每克藻泥獲得原生質(zhì)體的數(shù)目,即原生質(zhì)體產(chǎn)量除以實驗所用藻泥質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 兩種海藻原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率對比

對比2種藻原生質(zhì)體的制備效果(圖1),得出:1)細齒麒麟菜比長心卡帕藻的原生質(zhì)體制備效果更好,前者制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率都明顯高于后者,統(tǒng)計分析效果顯著(P＜0.01)。2)酶解時間延長有利于原生質(zhì)體制備。其中,在0.1 g藻泥加3 mL酶液處理組,48 h酶解時間內(nèi),長心卡帕藻原生質(zhì)體產(chǎn)量從 1.2 ×103cell上升到 1.45 ×103cell(圖 1.A),原生質(zhì)體產(chǎn)率從 1.20 ×104cell/g 增加到 1.45×104cell/g(圖1.C);而細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量從 1.35×103cell到1.75×103cell(圖 1.A),其產(chǎn)率從 1.35×104cell/g 增加到1.75 ×104cell/g(圖1)。3)實驗中海藻用量對酶解效果也產(chǎn)生明顯影響,在等量酶濃度下,藻量越多,原生質(zhì)體產(chǎn)量越高(圖1.A、B),而其產(chǎn)率卻越低(圖1.C、D)。其中,0.1 g的長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量分別只有 1.45 ×103cell和 1.75×103cell(圖1.A)內(nèi),而0.4 g的長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量分別達到3.83 ×103cell和4.15 ×103cell(圖1.B);相反,0.1 g的長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)率分別在 1.45 ×104cell/g 和 1.75×104cell/g (圖 1.C)范圍內(nèi),而0.4 g的長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)率只有0.96 ×104cell/g 和 1.04×104cell/g(圖 1.D)。

就獲得最大原生質(zhì)體產(chǎn)量而言,可選擇的酶解條件: 25℃和pH 6.0,以及0.4 g藻泥加3 mL酶液,其酶解時間為48 h(圖1.B)。在此酶解條件下,細齒麒麟菜原生質(zhì)體最大產(chǎn)量為4.15×103cell,而長心卡帕藻的原生質(zhì)體最大產(chǎn)量可達到 3.8×103cell(圖1.B)。為得到最高原生質(zhì)體產(chǎn)率,可選擇的酶解條件:25℃和pH 6.0,以及0.1 g藻泥加3 mL酶液,其酶解時間為48 h(圖1.C)。在此酶解條件下,細齒麒麟菜原生質(zhì)體最高產(chǎn)率達到1.75×104cell/g,而長心卡帕藻的原生質(zhì)體產(chǎn)率最高1.45×104cell/g(圖1.C)。

圖1 長心卡帕藻與細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率對比Fig.1 The comparation between total protoplast yields and the relative protoplast yields of E.denticulatum and K.alvarezii

2.2 藻泥與酶濃度配比對原生質(zhì)體制備的影響

不同藻泥與酶濃度配比對長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體制備效果如圖2。結(jié)果表明: 2種海藻的原生質(zhì)體制備效果與藻泥和酶濃度配比存在直接關(guān)系。在實驗酶濃度恒定和藻泥0.1～0.4 g范圍內(nèi),藻泥越多,所制備出的長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量越多(圖 2.A、B),即 0.4 g ＞ 0.2 g ＞ 0.1 g 藻泥酶解處理組;但原生質(zhì)體產(chǎn)率與藻泥用量呈負相關(guān)性,所用的藻泥越高,所制備的長心卡帕藻或細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)率越低(圖2.C、D),即0.4 g ＜0.2 g ＜ 0.1 g藻泥酶解處理組。上述結(jié)果與圖1結(jié)果一致,也進一步證實在等量酶濃度下,藻量越多,原生質(zhì)體產(chǎn)量越高。

在實驗酶解時間范圍內(nèi),2種海藻原生質(zhì)體與酶解時間存在一定相關(guān)性,隨著酶解時間延長,2種海藻原生質(zhì)體呈增加趨勢,但其產(chǎn)量和產(chǎn)率增加幅度略有不同(圖2)。

2.3 pH對原生質(zhì)體制備的影響

2種紅藻原生質(zhì)體制備與酶解酸堿度變化關(guān)系如圖3所示。從中可以看出,pH對2種海藻原生質(zhì)體制備存在一定程度的影響;總體而言,在弱堿性(pH8.0)條件下,無論長心卡帕藻還是細齒麒麟菜原生質(zhì)體產(chǎn)量(圖3.A、B),還是其產(chǎn)率(圖3.C、D)均低于中性(pH7.0)和弱酸性(pH6.0)的效果(P＜0.01);在中性(pH7.0)和弱酸性(pH6.0)條件下,2種海藻原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率基本一致,其中相對而言以弱酸性條件下酶解制備效果略高一點;隨著酶解時間延長,在3個實驗pH范圍內(nèi),原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率均呈明顯上升趨勢。

圖2 藻泥和酶濃度配比對長心卡帕藻(A、C)和細齒麒麟菜(B、D)原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of dosage of enzyme extract and algal pellets on protoplast isolation of K.alvarezii and E.denticulatum

圖3 pH對長心卡帕藻(A、C)和細齒麒麟菜(B、D)原生質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of pH on protoplast isolation of K.alvarezii and E.denticulatum

2.4 溫度對原生質(zhì)體制備的影響

長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體制備與酶解溫度變化關(guān)系如圖4所示。結(jié)果表明: 酶解溫度對原生質(zhì)體制備存在明顯影響,其中在25℃酶解條件下,兩種海藻的原生質(zhì)體產(chǎn)量一般都顯著高于20℃和 30℃時的產(chǎn)量(圖 4.A、B,P＜0.01);兩種海藻原生質(zhì)體產(chǎn)率也隨酶解溫度變化,呈現(xiàn)與其原生質(zhì)體產(chǎn)量相類似的結(jié)果(圖 4.C、D);同時,在三個酶解溫度梯度下,隨著酶解時間的延長,原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率均呈線性上升趨勢,并且以細齒麒麟菜在25℃酶解條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量和產(chǎn)率增幅最快(圖4.B、D)。

2.5 原生質(zhì)體制備效果觀察

長心卡帕藻和細齒麒麟菜勻漿后的藻渣,經(jīng)過籃子魚內(nèi)臟研磨提取液酶解,2種海藻細胞壁都可被有效酶解,依據(jù)酶解程度不同,制備出的原生質(zhì)體有完全游離的,也有部分原生質(zhì)體尚殘存細胞壁(圖5.B、D),游離原生質(zhì)體經(jīng)依文思藍染色,可檢查其細胞完整性,其中結(jié)構(gòu)完整的原生質(zhì)體不能吸收依文思藍,不被染色(圖 5.E),而染色后原生質(zhì)體深色的表明其結(jié)構(gòu)已經(jīng)受損,為不完整的破損原生質(zhì)體(圖5.F)。

在不同酶解條件下,所獲得原生質(zhì)體數(shù)目占藻細胞總數(shù)目比例依然較低,尚不足細胞總數(shù)的1%(圖6)。在實驗酶濃度恒定和0.1～0.4 g藻泥范圍內(nèi),藻泥越多,長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體比例越低(圖6.A);在本實驗pH梯度范圍內(nèi),pH 8.0時長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體比例都顯著低于 pH 6.0～7.0的酶解效果(P＜0.01),pH 6.0～7.0的酶解條件下,2種藻的原生質(zhì)體比例無顯著差異(圖6.B);25℃時2種藻的原生質(zhì)體比例顯著高于20℃和30℃時(圖6.C);在48 h酶解時間內(nèi),長心卡帕藻原生質(zhì)體隨時間延長逐漸升高(P＜0.01),而細齒麒麟菜在48 h時的原生質(zhì)體制備效率較比24 h略有下降(P＞0.05)。

圖4 溫度對長心卡帕藻(A、C)和細齒麒麟菜(B、D)原生質(zhì)體制備的影響Fig.4 Effect of temperature on protoplast isolation of K.alvarezii(A and C)and E.denticulatum(B and D)

圖5 長心卡帕藻 (A、B)和細齒麒麟菜 (C、D)酶解制備原生質(zhì)體效果Fig.5 Protoplast of K.alvarezii (A and B)and E.denticulatum (C and D)

圖6 不同酶解條件下原生質(zhì)體占總細胞數(shù)的比例Fig.6 The proportion of protoplast number to total free cell

3 討論

對不同制備溫度(20～30℃)的試驗,25℃酶解所制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著高于20℃和30℃酶解效果(圖3),這可能與籃子魚內(nèi)臟研磨提取液在25℃時有更高的酶活性有關(guān)?；诖?我們在后續(xù)實驗中,可在22～28℃范圍內(nèi),優(yōu)化酶解溫度。

在上述各實驗組的48 h酶解條件下,無論長心卡帕藻還是細齒麒麟菜的原生質(zhì)體,其產(chǎn)量均隨酶解時間的延長而增加,至少在 48 h酶解條件下,籃子魚內(nèi)臟粗提液仍具有酶的活性,延長酶解時間是否有效,有待后續(xù)深入研究。在3個酶解pH梯度實驗(圖4)中,pH 6.0時長心卡帕藻和細齒麒麟菜有更多原生質(zhì)體的產(chǎn)出,間接證明其在pH 6.0時酶活性更好。

在藻泥與酶濃度配比實驗中,酶解體系中長心卡帕藻或細齒麒麟菜藻泥含量越高,所制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量越高,而其產(chǎn)率卻隨藻泥濃度增加而降低(圖 2);酶液用量較藻泥比率越高,原生質(zhì)體產(chǎn)率越高(圖2)。基于飼喂籃子魚和從內(nèi)臟中研磨提取酶沒有制備藻泥方便,因此,可采用適當增大藻泥質(zhì)量并延長酶解時間,以有效提高原生質(zhì)體產(chǎn)量。

在藻泥與酶濃度配比實驗中,酶解體系中長心卡帕藻或細齒麒麟菜藻泥含量越高,所制備的原生質(zhì)體占總細胞數(shù)目的比例越低(圖6)。這與原生質(zhì)體產(chǎn)量隨藻泥與酶濃度配比變化則相反,而與產(chǎn)率變化一致。由此可見,藻泥含量增大導致獲得的游離細胞總數(shù)目增多和原生質(zhì)體數(shù)目增多,但其并沒有提高原生質(zhì)體數(shù)目占總細胞數(shù)目的比例。在原生質(zhì)體制備的溫度梯度(20～30℃)中,25℃酶解所制備的原生質(zhì)體數(shù)目占總細胞數(shù)目的比例顯著高于 20℃和30℃酶解效果(圖 6,P＜0.01),其與原生質(zhì)體產(chǎn)量隨溫度變化規(guī)律相一致。2種藻原生質(zhì)體占總細胞數(shù)目的比例隨pH變化規(guī)律與產(chǎn)量變化規(guī)律相似,pH為8.0時原生質(zhì)體產(chǎn)量和原生質(zhì)體所占的比例都低于pH為6.0和7.0時(圖3;圖6)。其可能是因為籃子魚內(nèi)臟研磨提取液中的酶組分在弱堿性的環(huán)境中酶活力較低。2種藻原生質(zhì)體產(chǎn)量都隨酶解時間延長而增加,其中長心卡帕藻原生質(zhì)體占總細胞數(shù)目的比例隨時間變化規(guī)律與產(chǎn)量結(jié)果一致,但細齒麒麟菜在酶解 24 h以后,原生質(zhì)體占總細胞數(shù)目的比例不再增加(圖 6.D),而僅僅是總的游離細胞數(shù)目增加導致原生質(zhì)體產(chǎn)量的提高。

Salvador等[27]以鮑魚內(nèi)臟提取液獲得長心卡帕藻原生質(zhì)體,并在25℃和pH 6.1條件下,同樣按0.1 g海藻材料加3 mL酶液的比例酶解48 h時,獲得最高酶解效率,其最大原生質(zhì)體產(chǎn)率為 8.2×103cell/g,這和我們的結(jié)果大致相同,所得提取液的效率(1.45×104Cell/g)的56%。Sahu等[28]將不同長心卡帕藻進行嫁接得到融合體植株,其生長速率更高,并且所產(chǎn)卡拉膠的黏度和強度都有提高。Cheney等[25]曾利用孢子制得紅藻原生質(zhì)體,并通過細胞融合的方法獲得了江蘺細胞融合體,進而獲得了生長速率更高的融合體植株。

本研究籃子魚內(nèi)臟粗提液酶解海藻藻泥的方法,成功制得了長心卡帕藻和細齒麒麟菜原生質(zhì)體。同時,實驗測定的了幾種不同酶解條件對酶解反應的影響,建議按0.4 g藻泥中添加3 mL酶液的濃度配比,在25℃,pH 6.0的酶解條件下酶解48 h以更有效地獲得海藻原生質(zhì)體。

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