多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB的研究

孫靜娜，劉青松，劉澤世，趙 帥，王國欣，張 征*

（1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031；2.河北省容城縣醫(yī)院普外科，河北 容城 071700）

多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB的研究

孫靜娜1，劉青松2，劉澤世1，趙 帥1，王國欣1，張 征1*

（1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031；2.河北省容城縣醫(yī)院普外科，河北 容城 071700）

目的 觀察多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌主動外排泵在耐藥方面的作用和外排泵基因表達情況。方法 通過比較加入羰基氰氯苯（carbonyl cyanldem-chlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制劑前后，96株鮑曼不動桿菌對四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的變化，篩選出34株外排泵表型陽性的鮑曼不動桿菌。用聚合酶鏈反應擴增對34株菌進行外排泵蛋白基因adeB的檢測和分析，并測序。結果 最終篩選出對4種抗生素MIC值均降低4倍及以上菌34株（35.42%），34株外排泵表型陽性的鮑曼不動桿菌檢測到adeB基因33株，檢出陽性率為97.06%。對33株鮑曼不動桿菌的外排泵基因adeB進行測序，經比對所測序列與基因庫（Genebank）中序列同源性為100.00%。結論 泵抑制劑CCCP對于逆轉鮑曼不動桿菌對四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種抗菌藥物的耐藥性起到重要作用，主動外排泵基因是鮑曼不動桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素。

鮑氏不動桿菌；抗藥性，多藥；基因表達

鮑曼不動桿菌在住院患者尤其是有免疫缺陷或重癥監(jiān)護病房患者尤為常見，75%住院患者可定植鮑曼不動桿菌，在醫(yī)院內則很容易通過交叉感染暴發(fā)流行［1］。耐藥鮑曼不動桿菌呈世界性流行，也已成為我國院內感染最重要的病原菌之一［2］。尤其是多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌在住院患者體內的出現(xiàn)，與不合理使用抗菌藥物增加細菌產生耐藥有關［3］。其中，多藥外排系統(tǒng)是鮑曼不動桿菌多藥耐藥的一個重要原因。特別是AdeABC外排泵參與了鮑曼不動桿菌對氨基糖甙類藥物、β-內酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。本研究對泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵系統(tǒng)進行基因檢測并測序，探討鮑曼不動桿菌主動外排泵系統(tǒng)在耐藥方面的作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源：本實驗所用菌株來自 2012—2013

年河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院72株多重耐藥鮑曼不動桿菌及24株泛耐藥鮑曼不動桿菌。取純培養(yǎng)細菌增菌液lmL與0.5mL 50%甘油肉湯混勻，－70℃冰箱保存并備用。

1.2 儀器：Maxwell-16核酸提取儀（美國Promega

公司），Mini-4K／6K微型離心機（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司），AB 9700PCR擴增儀（美國 AB公司），DYY-12電泳儀（北京六一儀器廠），VilBer LouRMAT凝膠成像系統(tǒng) （法國 VILBER LOURMAT公司），SIGMA 3-18K臺式冷凍離心機（德國Sigma公司）。

1.3 試劑：羰基氰氯苯腙（carbonyl cyanldemchlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制劑，泵抑制劑溶解試劑二甲亞砜購于河北博世林公司；抗菌藥物四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟均購于英國OXID公司；引物adeB由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；DNA提取試劑盒Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit購自 Promega公司；聚合酶鏈反應 （polymerase chain reaction，

PCR）擴增試劑 GoTaq?Green Master Mix和

GoTaq?Colorless Master Mix購自美國 Promega公司；DNA染色劑 Goldview和 DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司；瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 加入外排泵抑制劑前后抗菌藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）：采用微量肉湯稀釋法測定加入工作濃度的泵抑制劑CCCP前后，4種抗菌藥物四環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢噻肟對96株鮑曼不動桿菌的MIC，同時加入泵抑制劑和空白孔作為生長對照。

1.4.2 外排泵表型陽性鮑曼不動桿菌的判定：參考Sylvia Valdezate方法，比較應用CCCP泵抑制劑前后96株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物 MIC值的變化，以加入泵抑制劑后MIC值較不加泵抑制劑降低4倍或以上作為外排泵表型陽性的判定標準。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB：采用PCR技術檢測外排泵蛋白基因adeB。

1.4.3.1 adeB基因PCR引物的設計：根據(jù)基因庫（GenBanK）中已發(fā)布的各型基因序列和參考文獻［4］自行設計基因引物，擴增產物長度約 541bp，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物A，5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′（AF-370885）；引物B，5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′（AF370885）。

1.4.3.2 電泳：緩沖液0.5×TBE（電泳液配制10× TBE，108gTris堿、7.44g Na2EDTA·2H2O和55g硼酸，加超純水至 1L，使用時用水稀釋為0.5× TBE），電壓100V，上樣標本量8μL，DNA相對分子質量Maker（100bp）8μL，電泳50min；置于全自動凝膠圖像成像儀上觀察結果并照相，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當?shù)臈l帶判為陽性。

1.4.4 adeB基因測序：把陽性DNA條帶所在的凝膠切下，將PCR擴增產物和切下的含陽性DNA的凝膠送上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。用DNA Star軟件中的Editseq和Megalign分析測得的核苷酸序列，取雙向測序結果一致的序列作為參比序列，應用NCBI中BLAST程序比對序列。

2 結 果

2.1 4種抗菌藥加入CCCP泵抑制劑前后MIC變化情況：在加入CCCP泵抑制劑前后，96株多重耐藥株對四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟的MIC范圍分別由32～128、64～128、16～128、64～128mg／L變?yōu)?～64、1～128、1～64、8～128mg／L。 見表1。

表1 4種抗菌藥加入CCCP抑制劑前后MIC變化結果Table 1 The influence four antimicrobials of on MIC scope before and after pump inhibitors （mg／L）

2.2 篩選出外排泵表型陽性菌情況：96株多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌株篩選出外排泵表型陽性菌34株。在加入泵抑制劑CCCP后四環(huán)素的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者37株，降低2倍者 8株，沒有變化者 51株；諾氟沙星的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者41株，降低 2倍者 12株，沒有變化者 43株；慶大霉素的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 53株，降低2倍者9株，沒有變化者34株；頭孢噻肟的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 39株，降低2倍者 6株，沒有變化者51株。其中，篩選出34株鮑曼不動桿菌在加入CCCP泵抑制劑后4種抗生素MIC值均降低4倍。見表2。

表2 多重耐藥菌和泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵表型Table 2 The efflux phenotype positive of multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii （n ）

2.3 adeB基因的檢出情況：34株鮑曼不動桿菌檢測到adeB基因的有33株，檢出率為97.06%。adeB基因擴增電泳結果見圖1。

圖1 adeB基因擴增電泳結果M：DNA相對分子質量（100、250、500、750、1 000、2 000 bp）Figure 1 Electrophoresis of PCR product of adeB geneM：DNA marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）

2.4 adeB基因測序結果：取正反向雙向測序結果一致的序列作為參比序列，應用NCBI中BLAST程序比對序列，經比對所測序列與 Genebank中序列同源性均為100.00%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。adeB基因測序結果見圖2。

圖2 adeB基因測序結果Figure 2 The sequence of the adeB genes

3 討 論

鮑曼不動桿菌是引起院內感染的最為重要的機會致病菌。鮑曼不動桿菌通過其酶機制、外排泵、抗?jié)B性等極容易形成耐藥菌株。其中外排機制是將抗菌藥物及其復合物由生物膜內排至體外環(huán)境，其在細菌耐藥，尤其是多重耐藥中發(fā)揮重要作用［5］。主動外排泵是由菌體細胞膜表面蛋白組成的，可以將進入細菌體內的藥物排出到細胞外，外排泵的過度表達都可以引起鮑曼不動桿菌耐藥迅速增加［6］。AdeABC外排泵系統(tǒng)是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要因素。主動外排泵的過度表達引起介導了部分菌株對美羅培南的耐藥，而亞胺培南的耐藥性可能與外排泵機制無關［7］。多藥及毒性化合物外排家族的過度表達引起喹諾酮類、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素敏感性的降低［8］。

本實驗選取了四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種抗菌藥物作為外排底物；選取了CCCP泵抑制劑為篩選條件，CCCP分子在解離狀態(tài)下，可以在磷脂膜兩側自由擴散，而質子的傳遞破壞跨膜電化學梯度，因此CCCP是一種很強的解偶聯(lián)劑，可以阻斷菌體表面蛋白能量的供應，使外排泵無法正常工作，藥物不被外排而蓄積于菌體內，從而提高鮑曼不動桿菌對藥物的敏感性。本研究結果表明，四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟加入CCCP泵抑制劑前后 MIC范圍分別由 32～128、64～128、16～128、64～128mg／L變?yōu)?～64、1～128、1～64、8～128mg／L；四環(huán)素的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 37株，降低 2倍者 8株，沒有變化者51株；諾氟沙星的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者41株，降低2倍者12株，沒有變化者43株；慶大霉素的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 53株，降低2倍者9株，沒有變化者34株；頭孢噻肟的藥敏結果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性的共有 39株，降低 2倍者 6株，沒有變化者 51株。其中，篩選出34株鮑曼不動桿菌在加入CCCP泵抑制劑后4種抗生素MIC值均降低4倍。篩選出34例可能由于外排泵的存在而產生耐藥的鮑曼不動桿菌，說明CCCP外排泵抑制劑對逆轉鮑曼不動桿菌耐藥行之有效。

本研究進一步對34株外排泵表型陽性的鮑曼不動桿菌進行AdeABC外排泵的跨膜組件AdeB基因測定，檢測到 adeB基因 33株，檢出陽性率為97.06%。取正反向雙向測序結果一致的序列作為參比序列，應用NCBI中BLAST程序比對序列，經比對所測序列與 Genebank中序列同源性均為100.00%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。表明AdeABC外排泵機制在鮑曼不動桿菌對抗菌藥物敏感性方面的作用尤其重要，含有adeB基底泵的重組衍生體相對于不含有的菌株抗菌素的敏感性降低。與王同慧等［9］認為外排泵機制在鮑曼不動桿菌多重耐藥中具有重要作用結論一致。此外，結構基因的失活尤其是編碼轉錄蛋白的adeB，外排泵活性的增強以及不同的外排泵之間相互作用仍有待研究。

本研究為使用抗生素作用于多重耐藥鮑曼不動桿菌的靶位提供了實驗依據(jù)，也為臨床提高抗生素使用效率和研制開發(fā)新的抗菌藥物提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯：趙麗潔）

RESEARCH ABOUT EFFLUX PUMP GENE adeB IN MULTIDRUG RESISTANCE AND PANDRUG RESISTANTACINETOBACTER BAUMANNII

SUN Jingna1，LIU Qingsong2，LIU Zeshi1，ZHAO Shuai1，WANG Guoxin1，ZHANG Zheng1*
（1.Clinical Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050031，China；2.Department of General Surgery，the Hospital of Rongcheng County，Hebei Province，Rongcheng071700，China）

ObjectiveTo investigate efflux pump drug-resistance and gene expression in multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii.MethodsThe multidrug resistantAcinetobacter baumanniiefflux pump phenotypes were detected by joining carbonyl cyanidem-chloropheny hydrazone（CCCP）pump inhibitors，the minimum inhibitory concentration（MIC）variation was observed in 96 strains ofAcinetobacter baumanniiresistant to tetracycline，norfloxacin，gentamicin，cefotaxime，34 strainsofefflux phenotypepositiveAcinetobacter baumanniiwere screened out.The efflux pump protein gene adeB in 34Acinetobacter baumanniiwere detected and sequenced with the polymerase chain reaction amplification.ResultsThe initial selection involoed 34 strains（35.42%）whose MIC reduced by 4 times and above.In 34 stains of efflux pump phenotype positiveAcinetobacter baumannii，33 strains were detected adeB gene，the positive rate was 97.06%.When the 33 strainsAacinetobacter baumanniiadeB efflux pump gene were sequenced，the sequence homology was 100.00%compared in Genebank.ConclusionPump inhibitor CCCP plays an important role in the reversal ofAcinetobacter baumanniiresistant totetracycline，norfloxacin，gentamicin and cefotaxime，active efflux pump genes play an important role in multidrug resistantAcinetobacter baumannii.

acinetobacter baumannii；drug resistance，multiple；gene expression

R378.79

A

1007-3205（2014）10-1166-04

2014－04－25；

2014－06－12

孫靜娜（1976－），女，河北保定人，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院副主任檢驗師，醫(yī)學碩士，從事微生物學檢驗研究。

*通訊作者。E-mail：zhangzheng197101＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.016