卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP的建立及其與凋亡途徑蛋白的關(guān)系

申 薇，梁冰鋒，李秀榮，秦秀紅，程建新

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河北 石家莊 050091）

卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP的建立及其與凋亡途徑蛋白的關(guān)系

申 薇1，梁冰鋒2*，李秀榮1，秦秀紅2，程建新1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河北 石家莊 050091）

目的 通過順鉑（cisplatin，DDP）誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞珠SKOV3建立耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP，并研究其與凋亡途徑蛋白的關(guān)系。方法 應(yīng)用倒置顯微鏡觀察 DDP對細(xì)胞形態(tài)的影響，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測DDP對SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞的增殖抑制情況，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞中X鏈鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteine-aspartic acid protease-3，Caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤／白血病 2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）的表達(dá)情況。結(jié)果 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)DDP作用后，SKOV3／DDP細(xì)胞的增殖抑制率較SKOV3細(xì)胞顯著降低（P＜0.01），且存在著濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)（P＜0.01）。由半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）比較得 SKOV3／DDP細(xì)胞 24、48、72h耐藥指數(shù)（resistance index，RI）分別為2.434、2.950、3.780。FCM檢測表明，DDP作用后，SKOV3／DDP凋亡率顯著低于 SKOV3細(xì)胞（P＜0.01）。與SKOV3細(xì)胞相比，SKOV3／DDP細(xì)胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白高表達(dá)，Caspase-3蛋白低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 成功建立卵巢癌耐藥細(xì)胞株 SKOV3／DDP，其耐藥機(jī)制可能與 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的異常表達(dá)有關(guān)，表明這些蛋白參與了卵巢癌DDP耐藥的形成。

卵巢腫瘤；順鉑；抗藥性，腫瘤

嚴(yán)重威脅著女性的生命健康，該疾病5年生存率約為45%，甚至低于25%～30%［1－2］。鉑類藥物如順鉑（cisplatin，DDP）是目前卵巢癌治療的主要藥物之一，由于腫瘤的多藥耐藥性使得DDP在卵巢癌治療中并沒有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，嚴(yán)重影響了該藥物在臨床上的應(yīng)用效果［3］。耐藥的相關(guān)機(jī)制很多，其中耐藥蛋白的異常表達(dá)是重要因素之一，X鏈鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，

XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteineaspartic acid protease-3，Caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤／白血病2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）是細(xì)胞凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)4種蛋白在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，并且參與了腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用［4］。因此，建立卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP，分析細(xì)胞凋亡通路耐藥相關(guān)蛋白在卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞中的表達(dá)，研究耐藥機(jī)制，對提高抗腫瘤藥物治療的靶向性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.1.2 試劑和儀器：注射用DDP購自山東齊魯制藥廠，胰蛋白酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液購自美國Sigma公司，PBS、RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國 Gibco公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自天津化學(xué)試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自洛陽華美生物工程公司，兔抗人 Bcl-2和 XIAP多克隆抗體購自bioworld公司，鼠抗人 Caspase-3和 Survivin單克隆抗體購自北京中杉金橋試劑有限公司。流式細(xì)胞儀（Epics-XLⅡ型）購自美國 Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀（HT2-125500型）購自鄭州博賽生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株 SKOV3／DDP的誘導(dǎo)：采用DDP持續(xù)接觸濃度遞增的方法對SKOV3細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)，取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，于含有0.02 mg／L DDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐步提高DDP的誘導(dǎo)濃度，直到細(xì)胞能在含0.2mg／L DDP的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長，歷時(shí)8個(gè)月，將其命名為SKOV3／DDP細(xì)胞。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：取對數(shù)生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)：采用MTT法檢測SKOV3細(xì)胞、SKOV3／DDP細(xì)胞對DDP的敏感性。SKOV3／DDP細(xì)胞在不含DDP的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后備用，取對數(shù)生長期的SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含12%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以8.0×104／孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 100μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度DDP（1、2、4、8、16mg／L），0mg／L DDP組加入生理鹽水。置 37℃、5%CO2條件下分別孵育 24、48、72h后，每孔加入MTT溶液（5g／L）20μL，置37℃、5%CO 條件下繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，傾去培養(yǎng)液。每孔加入 150μL DMSO，振蕩 10min。選擇490nm波長，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值A(chǔ)490，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率和耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。增殖抑制率＝1－實(shí)驗(yàn)組A490值／對照組A490值；RI＝耐藥細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50）／親本細(xì)胞IC50。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞中蛋白的表達(dá)：取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化，4℃預(yù)冷的PBS洗2遍細(xì)胞后，離心棄去上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107／mL，向細(xì)胞懸液中加入 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin抗體，避光靜置 30min，加入二抗工作液100μL，對照組只加二抗。室溫靜置30min，上機(jī)檢測死亡受體XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivinn表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞4×105／孔接種于6孔板中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置一個(gè)加生理鹽水的空白對照組，其余為不同濃度 0、2、4、8mg／L DDP組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48h后收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1×107／mL，取 100μL細(xì)胞懸液向其中加入DNA染液（PI 50mg／L，RNA酶10mg／L及1%Triton-X100）1mL，在4℃冰箱中染色30min，上機(jī)檢測凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，分別采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP的培養(yǎng)：通過8個(gè)月的培養(yǎng)，成功獲得了SKOV3／DDP耐藥細(xì)胞株。倒置顯微鏡下觀察，SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞均貼壁生長，上皮細(xì)胞樣復(fù)層生長的SKOV3細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞數(shù)目多，透明，排列緊密，細(xì)胞圓亮飽滿，細(xì)胞間邊界清楚。SKOV3／DDP細(xì)胞較SKOV3細(xì)胞大，呈多角形，神經(jīng)元細(xì)胞樣生長，體積膨脹，核仁多，細(xì)胞質(zhì)可見顆粒狀囊泡，邊界模糊，折光性差。

2.2 DDP作用于SKOV3和SKOV3／DDP的增殖抑制率：隨著DDP濃度增高，SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞的增殖抑制率呈上升趨勢，同一細(xì)胞不同劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同一時(shí)間組比較，SKOV3／DDP細(xì)胞的增殖抑制率低于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

DDP作用SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞24、48、72h，SKOV3細(xì)胞的 IC50值分別為11.193、5.940、3.031，SKOV3／DDP細(xì)胞分別為27.241、17.522、11.456，由 IC50比較得 SKOV3／DDP細(xì)胞 24、48、72h RI分別為2.434、2.950、3.780，隨著時(shí)間的推移RI逐漸增加。

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

DDP（mg／L） SKOV3 24h 48h 72h F P 1 13.332±1.211 19.558±1.381 26.774±1.981 111.614 0.000 2 20.848±2.232 29.763±1.228 40.762±2.220 156.861 0.000 4 31.110±2.887 44.884±1.402 65.781±2.852 297.568 0.000 8 42.584±1.679 66.857±1.342 78.849±1.731 806.738 0.000 16 68.209±2.318 83.886±1.961 92.128±3.889 109.167 0.000 F 602.289 1 897.398 617.668 0.000 0.000 0.000 DDP（mg／L） SKOV3／DDP 24h 48h 72h P F P 1 7.234±0.891 10.453±1.317 15.451±1.229 76.404 0.000 2 12.671±1.112 17.891±1.011 23.562±2.548 61.029 0.000 4 19.776±1.881 25.770±1.563 33.879±3.211 55.349 0.000 8 27.219±2.228 34.463±1.451 42.861±2.987 64.776 0.000 16 42.113±2.149 52.227±2.327 67.887±4.223 108.928 0.000 F 367.104 615.364 273.358 P 0.000 0.000 0.000

2.3 SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)：SKOV3／DDP細(xì)胞XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)量顯著高于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SKOV3／DDP細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)量低于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞中的表達(dá)Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞中的表達(dá)Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

XIAP：X-linked inhibitor-of-apoptosis protein；Caspase-3：cysteine-aspartic acid protease-3；Bcl-2：B cell lymphoma／lewkmia-2

Proteins XIAP Caspase-3 Bcl-2 Survivin SKOV3 251.712±7.501 366.812±16.139 328.314±17.302 240.359±10.456 SKOV3／DDP 296.528±11.565 299.093±21.804 399.657±15.037 297.946±15.566 t 7.964 6.115 7.624 7.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 DDP對SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡的影響：DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞48h后，隨DDP濃度增高，細(xì)胞凋亡率顯著增加，且兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；2、4、8mg／L DDP組SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡率低于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 DDP對SKOV3／DDP和SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

表3 DDP對SKOV3／DDP和SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

*P＜0.01vs0mg／L ＃P＜0.01vs2mg／L △P＜0.01vs4mg／L byqtest DDP：cisplatin

Proteins DDP 0mg／L 2mg／L 4mg／L 8mg／L F P SKOV3 1.319±0.96 12.531±1.12*18.867±1.76*＃28.673±3.53*?！?78.043 0.000 SKOV3／DDP 1.669±0.68 6.908±0.56*8.121±0.89*＃19.133±1.12*＃△456.692 0.000 t 0.729 10.999 13.316 6.310 P 0.483 0.000 0.000 0.000

3 討 論

本研究利用藥物濃度逐步遞增的方法，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)了卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞株，即SKOV3／DDP細(xì)胞，與SKOV3細(xì)胞相比，其細(xì)胞體積和形態(tài)均發(fā)生顯著變化，與李宏等［5］的研究結(jié)果類似。DDP作用SKOV3／DDP細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞后，SKOV3／DDP細(xì)胞生長抑制率顯著低于SKOV3細(xì)胞，由IC50比較得SKOV3／DDP細(xì)胞24、48、72h RI分別為2.434、2.950、3.780，說明SKOV3／DDP細(xì)胞產(chǎn)生DDP耐藥。

XIAP蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，在免疫逃避、抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮了重要作用，許多惡性腫瘤中 XIAP高表達(dá)，且與不良預(yù)后具有相關(guān)性［6－7］。Survivin是凋亡抑制蛋白 成員之一，Survivin在細(xì)胞有絲分裂、增殖過程中起著關(guān)鍵性作用，其高表達(dá)可增強(qiáng)XIAP的活性，使細(xì)胞腫瘤逃避凋亡和轉(zhuǎn)移［8］。Caspases家族是以酶原形式存在的凋亡過程中的效應(yīng)蛋白，能通過蛋白酶的水解進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體3條通路中均存在Caspase不可逆的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，且Caspase-3是與凋亡通路最為密切的蛋白［9－10］。Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)基因蛋白，Bcl-2的高表達(dá)能夠抑制多種凋亡誘導(dǎo)因素所引發(fā)的細(xì)胞凋亡，主要通過抑制Caspase-3活性和Caspase-3底物PARP的分解達(dá)到抗凋亡的作用，Bcl-2的高表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞耐藥性的增高，是細(xì)胞發(fā)生耐藥的機(jī)制之一［11－12］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示SKOV3／DDP細(xì)胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)增高，Caspase-3蛋白表達(dá)降低，說明DDP在誘導(dǎo)敏感SKOV3細(xì)胞產(chǎn)生耐藥過程中，XIAP、Caspase-3、Bcl-2與Survivin均參與了卵巢癌SKOV3／DDP細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP產(chǎn)生DDP耐藥，其機(jī)制可能與細(xì)胞中凋亡途徑相關(guān)蛋白XIAP、Bcl-2與Survivin表達(dá)升高和 Caspase-3表達(dá)降低有關(guān)。耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP的建立，為卵巢癌DDP耐藥的進(jìn)一步研究提供了理想的細(xì)胞模型。

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（本文編輯：趙麗潔）

ESTABLISHMENT OF DRUG-RESISTANT CELL LINE SKOV3／DDP FOR OVARIAN CANCER AND ITS RELATIONSHIP WITH APOPTOSIS PATHWAY PROTEINS

SHEN Wei1，LIANG Bingfeng2*，LI Xiurong1，QIN Xiuhong2，CHENG Jianxin1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Nursing Faculty，Hebei Women Vocational Technology College，Shijiazhuang050091，China）

ObjectiveTo establish drug-resistant cell line SKOV3／DDP through ovarian cancer cell line SKOV3 by induced cisplatin（DDP），and to study its relationship with the apoptosis pathway proteins.MethodsThe inverted microscope was applied to observe DDP influence on the cell morphology.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to detect proliferation inhibition rate affected by DDP on SKOV3 and SKOV3／DDP cells.Flow cytometry（FCM）was used to detect the influence of cell apoptosis and the expression of X-linked inhibitorof-apoptosis protein（XIAP），cysteine-aspartic acid protease-3（Caspase-3），B cell lymphoma／lewkmia-2（Bcl-2）and Survivin proteins.ResultsMTT assay showed that proliferation inhibition rate of SKOV3／DDP cells decreased significantly compared with SKOV3 cells after DDP influence（P＜0.01），and depended on the concentration and time（P＜0.01）.The resistance index of DDP to SKOV3／DDP and SKOV3 cells in 24h，48h and 72h were respectively 2.434，2.950 and 3.780 by comparison between 50%concentration of inhibition values.FCM revealed that the apoptosis rates of SKOV3／DDP cells to DDP decreased obviously after 48h than those of SKOV3 cells（P＜0.01）.Compared with SKOV3 cells，the expression of XIAP，Bcl-2 and Survivin proteins in SKOV3／DDP cells were higher，while the expression of Caspase-3 protein was lower，and their differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionDrug-resistant cell line SKOV3／DDP for ovarian cancer is successfully established and its resistance mechanism is closely related with the abnormal expression of XIAP，Caspase-3，Bcl-2 and Survivin proteins.These proteins might be involved in the drug resistance of ovarian cancer.

ovarian neoplasms；cisplatin；drug resistance，neoplasm卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，臨床早期癥狀隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，多以浸潤、轉(zhuǎn)移和腹腔積液形成為特點(diǎn)，多數(shù)患者臨床確診時(shí)已為晚期，

R737.31

A

1007-3205（2014）10-1135-05

2014－07－03；

2014－09－02

河北省201 1年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（20110477）

申薇（1980－），女，天津人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事婦科腫瘤疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.007