胃癌中hMSH2和PTEN的表達及臨床意義

袁虎方，李 勇，檀碧波，趙 群，范立僑

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011）

·論 著·

胃癌中hMSH2和PTEN的表達及臨床意義

袁虎方，李 勇*，檀碧波，趙 群，范立僑

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011）

目的 探討人類mut-s同系物2（human mut-s homologue 2，hMSH2）和抑癌基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）在胃癌組織中的蛋白表達及與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 采用SP免疫組織化學(xué)法檢測42例胃癌組織及其相應(yīng)的近端癌旁組織（距癌組織3cm）、遠端癌旁組織（距癌組織＞10cm）及15例正常胃組織hMSH2和PTEN蛋白表達；采用Western Blot半定量檢測42例胃癌組織及相應(yīng)遠端癌旁組織（距癌組織＞10cm）hMSH2和PTEN蛋白表達。分析hMSH2和PTEN在胃癌組織中的蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織中 hMSH2和PTEN蛋白表達缺失率明顯高于近端癌旁組織、遠端癌旁組織及正常胃組織（P＜0.05或＜0.01）。PTEN蛋白表達缺失率與腫瘤分化程度負相關(guān)（rs＝－0.707，P＜0.05），與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（rs＝0.748、0.979、0.850、0.877，P＜0.05）。hMSH2和PTEN蛋白表達在胃癌中呈正相關(guān)。在胃癌組織中錯配修復(fù)基因hMSH2蛋白表達缺失伴有PTEN蛋白表達下調(diào)。結(jié)論 PTEN表達與胃癌臨床病理特征相關(guān)；在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中錯配修復(fù)蛋白hMSH2表達缺失伴有PTEN蛋白表達下調(diào)。

胃腫瘤；基因表達；疾病特征

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐漸上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。對胃癌有關(guān)癌基因、抑癌基因的改變進行研究，有助于加深理解胃癌生物學(xué)本質(zhì)的認識，為探討胃癌發(fā)生發(fā)展機制及指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn)，錯配修復(fù)基因（mismatch repair，MMR）——人類mut-s同系物2（human mut-s homologue 2，hMSH2）［1］以及抑癌基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）［2］均與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3－4］。但兩者在胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中有無相互影響鮮有報道。本研究探討hMSH2和PTEN在胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中作用以及相互關(guān)系，旨在為胃癌臨床診斷、惡性程度評估以及預(yù)后分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本采集：2010年1月—2011年12月在我院接受治療的原發(fā)性胃癌患者42例，取患者癌組織、近端癌旁組織（距癌組織3cm）、遠端癌旁組織（距癌組織＞10cm）及15例正常胃組織（為外傷、潰瘍病、息肉同期在我院住院手術(shù)切除的或內(nèi)鏡活組織檢查的非腫瘤胃組織）標本各 2份。1份迅速放入－80℃冰箱中以保持新鮮備用，另1份經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、石蠟包埋備用。所取胃癌原發(fā)灶標本均經(jīng)病理醫(yī)師確診。胃癌患者男性34例，女性8例，年齡37～75歲，平均（63.2±2.05）歲；高中分化癌16例，低未分化癌26例；侵透漿膜18例，未侵透漿膜24例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 22例。TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期 26例，Ⅲ＋Ⅳ期 16例。術(shù)前均未進行放、化療等抗腫瘤措施。所有標本均為手術(shù)切除的新鮮標本。正常對照組患者15例，男性9例，女性 6例，年齡 18～62歲，平均（47.18± 5.62）歲；腹部外傷胃破裂修補術(shù)1例，潰瘍病2例，胃息肉12例。

1.2 主要試劑：hMSH2兔抗人多克隆抗體購自Biolegend公司，工作濃度 1∶100；PTEN兔抗人多克隆抗體購自 Biolegend公司，工作濃度 1∶50；SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉生物技術(shù)公司。Tris-Hcl工作濃度 50mmol／L； NP40購自華美生物工程公司，工作濃度1%；脫氧膽酸鈉工作濃度0.5%SDS工作濃度0.1%；Aprotinin購自Amrcsco公司，工作濃度10mg／L；預(yù)染蛋白標準購自美國Fermentas公司；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒購自南京建成生物試劑公司；蛋白酶K購自拜昂生物技術(shù)有限公司。

1.3 SP免疫組織化學(xué)檢測：將收集的標本經(jīng)100g／L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制成3～4μm連續(xù)切片，按試劑盒說明書進行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，中性樹膠封片。取已知陽性組織作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。hMLH2和PTEN在正常胃組織中高表達，hMLH2胞漿及胞核均著色。PTEN以胞漿著色為主。細胞核和（或）胞漿染成棕黃色顆粒為陽性表達。陽性細胞計數(shù)方法，高倍鏡下（400倍）每張組織切片記數(shù)5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，取陽性細胞數(shù)百分比的平均值。陽性細胞數(shù)占11%～50%時為低表達，51%～100%為高表達。若切片中陽性細胞數(shù)≤10%時為表達缺失。計算hMSH2、PTEN蛋白在胃癌及其近端癌旁組織、遠端癌旁組織和正常對照組織表達缺失率，缺失率＝陰性例數(shù)／總例數(shù)。

1.4 Western Blot檢測：①提取組織總蛋白，剪碎組織，PBS漂洗2遍。加裂解緩沖液作用10min，制成勻漿。離心取上清液，用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒定量分析，每次檢測前用β-actin抗體標準化監(jiān)測。②配置SDS-PAGE，標本上樣。③10 mA穩(wěn)流條件電泳3h。④轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3h。⑤加一抗，4℃過夜，TTBS漂洗3次；加二抗，37℃ 1h，TTBS漂洗3次。⑥D(zhuǎn)AB顯色，采用凝膠分析系統(tǒng)進行照相、分析。凝膠成像系統(tǒng)（UVP，美國）LabWorks 4.5軟件對蛋白表達行半定量分析，以積分光密度（integrated optical density，IOD）值表示。以相對IOD值比較蛋白表達高低。相對IOD值＝hMSH2和PTEN蛋白的IOD值／相應(yīng)βactin蛋白的IOD值。判定標準，以正常組織相對 IOD值作為參照標準，計算 95%參考值范圍，對癌組織相對IOD值進行判斷，低于下限則判為低表達，高于上限則判為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗和秩和檢驗；相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測hMSH2與PTEN蛋白表達：hMSH2在胃癌組織表達（圖1）缺失率明顯高于在近端癌旁組織、遠端癌旁組織、正常胃組織（圖2），近端癌旁組織、遠端癌旁組織和正常胃組織間表達缺失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PTEN在胃癌組織表達（圖3）缺失率高于近端癌旁組織、遠端癌旁組織、正常胃組織表達（圖 4）缺失率（P＜0.05），而近端癌旁組織、遠端癌旁組織和正常胃組織間表達缺失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 hMSH2、PTEN蛋白在各組組織中的表達Table 1 Expressions of hMSH2 and PTEN in different tissues （n）

hMSH2表達缺失率在患者的不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤分化程度、漿膜侵犯程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PTEN表達缺失率在患者的不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在腫瘤低分化程度、侵犯漿膜、TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較相應(yīng)組表達缺失率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 hMSH2和PTEN蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 Relationship of hMSH2 and PTEN expressions with pathological features （n）

表2 （續(xù)）

PTEN表達缺失率與腫瘤分化程度呈負相關(guān)（rs＝－0.707，P＜0.05），與侵犯漿膜程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（rs＝0.748、0.979、0.850，P＜0.05）。

2.2 Western Blot法檢測胃癌組織 hMSH2和PTEN蛋白表達：β-actin、hMSH2、PTEN蛋白相對分子質(zhì)量為42 000、110 000、55 000，Western Blot雜交后分別在42 000、110 000、55 000位置出現(xiàn)陽性條帶。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對雜交條帶進行半定量分析，蛋白含量以IOD表示。每次檢測蛋白時均檢測β-actin蛋白，以其為標準對所檢測hMSH2、PTEN蛋白進行定量。與對照組織相比例胃癌組織中hMSH2蛋白 21例呈低表達，其低表達率為50.00%。胃癌組低表達率明顯高于遠端癌旁組織（0／42），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；遠端癌旁組織中1例（1／42，2.38%）PTEN蛋白低表達，42例胃癌組織中 17例（40.48%）PTEN蛋白低性表達。胃癌組低表達率高于遠端癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝18.101，P＜0.01）。

在胃癌組織中hMSH2與PTEN蛋白表達呈正相關(guān)（免疫組織化學(xué)檢測中rs＝0.679，Western Blot法檢測中rs＝0.816，P＜0.05）。錯配修復(fù)蛋白hMSH2表達缺失常伴有PTEN蛋白表達缺失。

3 討 論

近幾年來，隨著癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，對腫瘤的認識已經(jīng)提高到分子水平。多種癌基因、抑癌基因表達的蛋白在細胞周期的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同維持著細胞周期的正常進行。當它們的功能失調(diào)時，細胞周期也會隨即出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，癌基因、抑癌基因與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

錯配修復(fù)基因是癌基因和抑癌基因的上游調(diào)節(jié)基因，通過修復(fù)堿基錯配、小片段插入或缺失等DNA損傷和基因結(jié)構(gòu)異常而降低基因突變率，維持基因組和遺傳信息的穩(wěn)定性［5］。所以，作為MMR基因中的 hMSH2基因極有可能會對抑癌基因PTEN產(chǎn)生影響，hMSH2識別堿基錯配的能力下降，使失活的PTEN基因得不到有效修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。這可能就是本研究中hMSH2與PTEN呈正相關(guān)的結(jié)果理論基礎(chǔ)。

hMSH2基因是第1個被發(fā)現(xiàn)并分離的人類錯配修復(fù)基因，位于染色體2p21～22，基因組DNA全長約73kb，含16個外顯子。hMSH2可能通過以下3個途徑起作用：增加癌基因和或抑癌基因的突變率［6－7］；錯配修復(fù)功能缺陷；通過化學(xué)物質(zhì)使細胞損傷導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

PETN是迄今第1個被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯和細胞凋亡等抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，其突變和異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是患者預(yù)后不良的標志。PTEN基因表達缺失可促進胃癌血管生成，并在胃癌的進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用；其表達下調(diào)在胃癌的發(fā)生、進展、生長、分化和血管生成中起重要作用。

本研究通過免疫組織化學(xué)檢測hMSH2、PTEN蛋白的表達，結(jié)果顯示，胃癌組織中hMSH2蛋白的表達缺失率顯著高于近端癌旁組織、遠端癌旁組織及正常胃組織。與文獻報道［8］一致。提示胃癌的發(fā)生可能與錯配修復(fù)基因的突變有關(guān)，錯配修復(fù)基因的突變引起錯配修復(fù)酶的缺乏，從而發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，這可能是部分胃癌發(fā)生的病理基礎(chǔ)；但其表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、漿膜侵犯程度、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。提示胃癌hMSH2蛋白表達的特性可能在細胞惡變時即已形成，不隨癌細胞的分化和生長情況而改變。

PTEN可以多途徑地抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，其中穩(wěn)定和增強腫瘤細胞間的黏附起著至關(guān)重要的作用。PTEN以E-鈣黏蛋白依賴性方式誘導(dǎo)細胞聚集、抑制細胞的離散和浸潤表型。異位表達的PTEN能誘導(dǎo)細胞聚集，抑制細胞的離散和浸潤表型，但E-鈣黏蛋白失活后，PTEN誘導(dǎo)細胞聚集、抑制細胞離散和浸潤表型的作用消失［9］。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中PTEN蛋白的表達缺失率顯著高于近端癌旁組織、遠端癌旁組織及正常胃組織；PTEN表達缺失率與分化程度、漿膜侵犯程度、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負或正相關(guān)。提示PTEN蛋白表達缺失可能與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

本研究還采用 Western Blot檢測 hMSH2和PTEN在胃癌組織和遠端瘤旁組織的蛋白表達，其表達結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，2個基因的蛋白在胃癌組織中的表達水平遠低于遠端瘤旁組織，兩者呈正相關(guān)。也就是說，胃癌組織中hMSH2和PTEN基因的表達缺失率高于遠端瘤旁組織；有hMSH2蛋白表達缺失率高的胃癌組織常伴有PTEN表達缺失率增高。

分析抑癌基因hMSH2和PTEN在胃癌組織中的表達缺失情況及其間的關(guān)系有助于了解胃癌的發(fā)病機制，hMSH2表達異常和PTEN表達下調(diào)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。

總之，PTEN表達與其臨床病理特征相關(guān)；在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中錯配修復(fù)基因hMSH2蛋白表達缺失伴有PTEN蛋白表達下調(diào)。hMSH2與PTEN聯(lián)合檢測對胃癌的病因?qū)W研究、腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能的評估有著重要的意義?？勺鳛榕袛辔赴┺D(zhuǎn)移、預(yù)后和制定治療方案的一個聯(lián)合型分子生物學(xué)的觀測指標，對于此類高表達的患者，我們可以給予更為積極有針對性的綜合治療。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

EXPRESSION OF hMSH2 AND PTEN IN SPORADIC GASTRIC CARCINOMA

YUAN Hufang，LI Yong*，TAN Bibo，ZHAO Qun，F(xiàn)AN Liqiao
（Third Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050011，China）

ObjectiveTo investigate the expression of human mut-s homologue 2（hMSH2）and phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten（PTEN）in sporadic gastric carcinoma，and thereby to elucidate their relationship and clinical significance.Methods

The expression levels of hMSH2 and PTEN were detected using immunohistochemistry in 42 cases with sporadic gastric carcinoma，its corresponding adjacent tissues（3cm away from cancerous tissues），distal tissues（from cancer＞10cm）and 15 cases of normal gastric tissues.The expression levels of hMSH2 and PTEN protein were analyzed using Western Blot in 42 patients with sporadic gastric carcinoma and its corresponding distal controls.ResultsLoss rate of expression of hMSH2 and PTEN in gastric cancer were higher than that of proximal tumoradjacent gastric carcinoma tissues，distal tumor-adjacent gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues（P＜0.05 orP＜0.01）.PTEN loss rate showed negative correlation with the degree of tumor differentiation（rs＝－0.707，P＜0.05），but positive correlation with TNM staging，invasive depth，and lymph node metastasis（P＜0.05）.hMSH2 and PTEN were positive correlated in gastric cancer.There was a decreasing expression in expression losses of mismatch repair geneand hMSH2.ConclusionPTEN protein expression is correlated with clinic and pathological features.The expression deletion of mismatch repair protein hMSH2 was accompanied by downregulated PTEN protein expression in sporadic gastric carcinoma.

stomach neoplasms；gene expression；disease attributes

R735.2

A

1007-3205（2014）10-1121-05

2014－04－02；

2014－05－09

袁虎方（1978－），男，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士研究生，從事消化系統(tǒng)疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.002