重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標(biāo)變化趨勢研究

申 偉，李清懷，李筱雨，嚴(yán) 麗，張霖雷

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺外科，河北 石家莊 050017）

·論 著·

重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標(biāo)變化趨勢研究

申 偉，李清懷*，李筱雨，嚴(yán) 麗，張霖雷

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺外科，河北 石家莊 050017）

目的 觀察重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠腎損傷的血清及尿液生化指標(biāo)變化趨勢。方法 選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠240只，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)均分為8組各30只，即SAP不同時(shí)間點(diǎn)組（SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h、24h組）和對(duì)照組。比較各組大鼠血清淀粉酶（amylase，AMY）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血尿酸（uric acid，UA）以及尿液中肌酐（urine creatinine，UCr）濃度、腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1以及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl amino glycosidase enzymes，NAG）含量的變化。結(jié)果 SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組SCr、BUN、UA濃度、KIM-1含量和NAG相對(duì)濃度均高于對(duì)照組，UCr濃度均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 SAP腎損傷中，腎小管的損傷早于腎小球的損傷。KIM-1和 NAG作為判定腎小管損傷的指標(biāo)，敏感度和特異度均優(yōu)于Cr、BUN和UA，且能早期診斷SAP時(shí)腎損傷。

胰腺炎，急性壞死性；急性腎損傷；生物學(xué)標(biāo)記

1 材料與方法

1.1 一般資料：選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠240只（購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），月齡1～3個(gè)月，平均（1.8±0.7）個(gè)月，清潔級(jí)，體質(zhì)量 250～300g，平均（274.2±12.4）g。按照隨機(jī)數(shù)字表將240只大鼠隨機(jī)均分為 SAP不同時(shí)間點(diǎn)組（SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h、24h組）和對(duì)照組，每組 30只。各組大鼠月齡、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2 模型制備及標(biāo)本采集：大鼠實(shí)驗(yàn)前14h開始禁食，自由飲水，參照郝建志等［2］的方法制備 SAP模型。對(duì)照組大鼠進(jìn)入腹腔后僅翻動(dòng)十二指腸部數(shù)次即關(guān)腹。造模后，所有大鼠均皮下注射生理鹽水5mL，以補(bǔ)充血容量。SAP模型制備成功后于1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h分批取材。心臟抽血約4mL，2 000r／min離心10min分離血清，將血清標(biāo)本裝入 EP管中，－80℃低溫保存。12h后大鼠均為無尿狀態(tài)，故留取1h、3h、6h、9h和12h組大鼠尿液，1 000r／min離心 10min，取上清，－20℃低溫保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)

1.3.1 血清指標(biāo)測定：采用碘－淀粉比色法測定血清淀粉酶（amylase，AMY），采用高效液相色譜法測定血清肌酐（serum creatinine，SCr），采用尿素酶－連續(xù)監(jiān)測法測定血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）以及采用尿酸酶過氧化物酶偶聯(lián)－終點(diǎn)法測定血清尿酸（uric acid，UA）濃度。

1.3.2 尿液標(biāo)本指標(biāo)測定：采用堿性苦味酸法測定尿肌酐（urine creatinine，UCr），采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測定腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1以及按照大鼠β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl amino glycosidase enzymes，NAG）測定試劑盒說明書測定NAG含量。

1.4 腎損傷的病理學(xué)評(píng)分：在400倍光鏡下隨機(jī)選3個(gè)視野，每個(gè)視野選10個(gè)腎小管評(píng)分。腎小管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞扁平為 1分；刷狀緣損傷為 1分，脫落為2分；細(xì)胞漿空泡 1分；間質(zhì)水腫 1分；腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞未形成管型或碎片為 1分，形成管型或碎片為2分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用 q檢驗(yàn)。腎損傷評(píng)分采用Kruska-lWallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用 Nemenyi法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清指標(biāo)比較：SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組血AMY含量呈逐漸增高趨勢，且高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h組SCr、BUN和UA濃度呈逐漸增高趨，24h組有所下降，但高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 尿液指標(biāo)比較：SAP各時(shí)間點(diǎn)組UCr濃度呈逐漸下降趨勢，且低于對(duì)照組，KIM-1含量和NAG相對(duì)濃度呈逐漸增高趨，且高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 大鼠腎損傷的病理學(xué)評(píng)分：SAP 1h、3h、6h、9h、12h、18h和24h組大鼠腎損傷的病理學(xué)評(píng)分分別為（6.00±3.57）、（18.77±6.52）、（55.89±10.85）、（111.71±15.33）、（146.94±15.45）、（171.22± 16.93）和（208.00±13.23）分，呈逐漸增高趨勢，均高于對(duì)照組的（3.33±3.20）分，經(jīng) Kruska-lWallis檢驗(yàn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行Nemenyi檢驗(yàn)示，除對(duì)照組與 1h組、18h組和 24h組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同組別AMY、SCr、BUN和UA水平變化趨勢Table 1 The change of AMY，SCr，BUN and UA level in different groups（n＝30，）

表1 不同組別AMY、SCr、BUN和UA水平變化趨勢Table 1 The change of AMY，SCr，BUN and UA level in different groups（n＝30，）

*P＜0.01vscontrol group ＃P＜0.01vsSAP 1h group △P＜0.01vsSAP 3h group ▲P＜0.01vsSAP h group ▼P＜0.01vsSAP 9h group ☆P＜0.01vsSAP 12h group ★P＜0.01vsSAP 18h group byqtestSAP：severe acute pancreatitis；AMY：amylase；SCr：serum creatinine；BUN：blood urea nitrogen；UA：uric acid

Groups AMY（U／L） SCr（μmol／L） BUN（mmol／L） UA（μmol／L）Control group 596.9±248.1 50.31±9.75 7.03±4.01 92.23±28.98 SAP 1h 1 437.9±331.9*54.80±9.38 8.95±3.37 104.40±31.86 SAP 3h 2 052.0±290.4*＃56.30±8.69 11.83±3.46*113.70±28.81*SAP 6h 3 152.9±301.4*＃△70.19±11.25*?！?5.56±4.02*?！?45.46±33.30*＃△SAP 9h 4 944.5±308.5*?！鳌?6.13±12.72*?！?8.96±3.88*?！鳌?88.33±33.97*＃△▲SAP 12h 5 162.8±315.9*?！鳌?5.78±13.15*＃△▲▼25.17±4.94*?！鳌?17.78±43.19*?！鳌婼AP 18h 8 236.7±381.9*?！鳌嫛?26.11±14.24*?！鳌嫛?3.11±5.53*＃△▲▼☆384.44±60.02*?！鳌嫛頢AP 24h 11 800.0±200.7*?！鳌嫛睢?1.33±12.10*?！鳌睢?1.33±3.06*?！鳌睢?68.00±15.10*＃△☆★F 4 712.944 132.242 381.583 200.882 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 不同組別KIM-1、UCr和NAG水平變化趨勢Table 2 The change of KIM-1，UCr and NAG level in different groups （n＝30，）

表2 不同組別KIM-1、UCr和NAG水平變化趨勢Table 2 The change of KIM-1，UCr and NAG level in different groups （n＝30，）

*P＜0.01vscontrol group ＃P＜0.01vsSAP 1h group △P＜0.01vsSAP 3h group ▲P＜0.01vsSAP 6h group ▼P＜0.01vsSAP 9h group byqtestSAP：severe acute pancreatitis；KIM-1：kidney injury molecule-1；UCr：urine creatinine；NAG：β-N-acetyl amino glycosidase enzymes

Groups KIM（ng／L） UCr（mmol／L） NAG／UCr（U／mmol）Control group 40.60±29.07 2.01±0.33 17.18±9.13 SAP 1h 62.22±31.12*1.91±0.34 18.66±8.95 SAP 3h 78.09±34.02*1.81±0.30 51.21±11.62*＃SAP 6h 87.83±33.22*＃1.12±0.32*?！?08.93±10.42*?！鱏AP 9h 101.44±35.94*＃△0.95±0.26*?！?34.05±10.10*?！鳌鳶AP 12h 119.37±30.78*?！鳌?.53±0.25*?！鳌?05.25±10.16*＃△▲▼F 22.400 120.92 1 614.741 P 0.000 0.000 0.000

3 討 論

SAP是臨床常見的急腹癥之一，它不僅引起胰腺本身及胰周的炎性腫脹、滲出和壞死，而且常導(dǎo)致全身重要臟器功能的損害，是一種發(fā)病急、進(jìn)展快、并發(fā)癥多、病死率高的嚴(yán)重疾病，病死率可達(dá)20%～40%［3－4］。SAP時(shí)常并發(fā)多系統(tǒng)器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），成為SAP的主要死亡原因。腎衰竭是SAP常見的并發(fā)癥。筆者使用3.5%?；悄懰徕c溶液逆行注射大鼠胰膽管，制備大鼠 SAP模型，SAP 1h組血清AMY比對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），表明SAP模型建立成功。SAP各組大鼠腹部膨隆，腹腔內(nèi)有大量腹腔積液，胃腸極度擴(kuò)張，體液丟失于腹腔及腹膜外間隙中，致使血容量銳減，血壓下降，腎濾過壓降低，腎小球?yàn)V過率下降，加之腎臟缺血，易于發(fā)生腎損傷。SAP各時(shí)間點(diǎn)組病理學(xué)評(píng)分均高于對(duì)照組。

SCr、BUN和UA為3種非蛋白質(zhì)含氮化合物，分別是肌酸、蛋白質(zhì)和核酸的代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)腎小球?yàn)V過隨尿排除，腎臟對(duì)其重吸收和排泌量少。腎功能發(fā)生障礙時(shí)，由于腎小球?yàn)V過率下降，血液中3種化合物的濃度增加［5］。SCr、BUN、UA均于造模6h后才有明顯的升高，由此可見SAP發(fā)生后并未立即發(fā)生腎小球功能的損傷［6］，12h后又加快，這種變化如同 AMY的變化一樣要經(jīng)歷一個(gè)“平臺(tái)期”，這就又進(jìn)一步證實(shí)了病程中機(jī)體的抗損傷作用，但這種抵抗作用畢竟有限。三者于18h達(dá)到高峰，隨即開始下降，但至24h的數(shù)值仍然高于正常值水平。這種下降說明在腎損傷病程的后期，SCr、BUN和UA不能作為判定指標(biāo)。UCr主要來自血液，經(jīng)過腎小球過濾后隨尿液排除體外，腎小管基本不吸收且排出很少。UCr測定與 SCr剛好相反，UCr越高，說明腎臟的排除肌酐毒素功能越強(qiáng)，反之越差。臨床上，如果UCr排出增多，一般可說明，腎功能好轉(zhuǎn)，病情在向好的方向發(fā)展，反之越差。SCr、BUN和UA為反映腎小球功能的經(jīng)典指標(biāo)，能很好地體現(xiàn)出腎小球?yàn)V過功能受損的情況。但由于腎臟代償功能強(qiáng)大，只要有 30%功能腎單位存在，上述指標(biāo)就可以維持在正常水平，所以 SCr、BUN和UA不是反映腎功能的靈敏指標(biāo)，不能作為腎功能早期受損的指標(biāo)。

近年來研究［7］表明，SAP敗血癥時(shí)的腎衰竭是由于免疫或毒素的應(yīng)激引起的急性腎小管凋亡導(dǎo)致的，而不是簡單的血流動(dòng)力學(xué)紊亂引起的。因此，對(duì)于腎小管功能的評(píng)估受到越來越多的重視和研究。

Ichimura等［8］采用表象差異分析在缺血－再灌注大鼠腎細(xì)胞中識(shí)別一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，命名為KIM-1，其大量表達(dá)于缺血－再灌注損傷后再生的近曲小管上皮細(xì)胞，而在正常腎組織中表達(dá)甚微。當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞受損時(shí)，KIM-1的產(chǎn)物能夠通過尿中排出，尿中KIM-1水平能夠反映組織中KIM-1表達(dá)情況及炎癥反應(yīng)程度，并與腎臟功能密切相關(guān)。因此，檢測尿中KIM-1水平可以間接評(píng)價(jià)腎臟損傷的情況。同時(shí)研究［9］表明，KIM-1不受尿液理化性質(zhì)改變的影響，可在尿中長時(shí)間保持穩(wěn)定，避免了測定尿液其他指標(biāo)時(shí)所存在的干擾。本研究結(jié)果顯示，KIM-1在造模1h后就已經(jīng)開始升高，幾乎與SAP的發(fā)生“同步”，并且隨著病情的加重而持續(xù)上升，而此時(shí)腎小管尚未有鏡下的改變，直至造模后3h鏡下才出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的水腫，9h偶見上皮細(xì)胞壞死。因大鼠于造模12h之后處于無尿狀態(tài)，故18h與 24h未能留取足夠的尿液進(jìn)行檢測。但是KIM-1的變化趨勢與腎損傷評(píng)分的變化趨勢一致。因此在SAP造成的腎損傷中，腎小管的損傷要早于腎小球的損傷。

NAG是廣泛存在于各組織溶酶體中的一種高相對(duì)分子質(zhì)量（140 000）的酸性水解酶，近端腎小管上皮細(xì)胞中含量特別豐富，正常情況下，血清中的NAG不能通過腎小球?yàn)V過膜，因而NAG可作為腎小管功能損害最敏感的指標(biāo)之一［10－11］。因尿酶濃度隨尿流率而變動(dòng)，用“酶單位／肌酐”比值來計(jì)算酶排出率，以校正尿量變化對(duì)尿酶活性的影響，效果較好［12］。本研究結(jié)果表明，不做校正的NAG值變化于造模9h后呈下降趨勢，經(jīng)校正后，于造模9h后仍然呈現(xiàn)上升趨勢，從而排除了尿量減少對(duì)結(jié)果的影響，使指標(biāo)更貼近于實(shí)際情況。NAG同KIM-1一樣也于造模后1h開始升高，敏感度較高。

KIM-1、NAG作為反映腎小管功能受損的指標(biāo)，在SAP發(fā)生早期即有所升高，明顯早于其他反映腎損傷的指標(biāo)。因此，可以對(duì)腎損傷進(jìn)行早期診斷，特異性和敏感性均較高。這也驗(yàn)證了SAP并發(fā)腎損傷的起始部位是腎小管，支持了炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的作用，因此腎小管發(fā)生損傷決定著腎臟疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。至于腎小球損傷是否是由腎小管損傷而引起，需要進(jìn)一步研究。本研究采用的腎損傷組織學(xué)評(píng)分，主要反映的是腎小管損傷，造模后18h與24h評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此時(shí)鏡下觀察腎小管損傷嚴(yán)重，上皮細(xì)胞壞死脫落，管腔內(nèi)管型形成，甚至阻塞管腔，且18h的鏡下也開始出現(xiàn)腎小球的瘀血，這說明腎小球出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變后，腎小管損傷的加重相對(duì)停止。腎小管的損傷或許是個(gè)觸發(fā)因素，加重了腎小球損傷。但具體作用機(jī)制尚需研究。

綜上所述，腎損傷的程度隨SAP病程延長和病情加重呈遞增趨勢，但發(fā)病9h是個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，損傷程度相對(duì)減緩；且腎小管的損傷早于腎小球損傷的發(fā)生。KIM-1和NAG作為判定腎小管損傷的指標(biāo)，敏感度和特異度均較好，優(yōu)于Cr、BUN和UA，且能夠進(jìn)行早期診斷，對(duì)判斷SAP時(shí)腎損傷的程度及預(yù)后有重要意義。

［1］張彥波，劉林昌.重癥急性胰腺炎相關(guān)性腎損傷的發(fā)病機(jī)制［J］.臨床腎臟病雜志，2012，12（2）：94－96.

［2］郝建志，方馳華，范應(yīng)方，等.一種效果確切的大鼠重癥急性胰腺炎模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（28）：5193－5196.

［3］王飛.重癥急性胰腺炎200例病因回顧分析［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：312－313.

［4］鄭吉敏，劉娜，張建，等.114例急性胰腺炎臨床特點(diǎn)分析［J］.臨床薈萃，2014，29（4）：445－446.

［5］張彥榮，張俊現(xiàn)，張峰，等.誘生型一氧化氮合酶與骨骼肌缺血再灌注腎損傷相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，12（31）：1485－1487.

［6］張留柱.重癥急性胰腺炎腎損傷的發(fā)病機(jī)制［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2011，13（5）：128－130.

［7］周超，湯禮軍.重癥急性胰腺炎相關(guān)性腎損傷的發(fā)病機(jī)制及早期檢測診斷研究進(jìn)展［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24（8）：72－74.

［8］ICHIMURA T，BROOKS CR，BONWENTRE JV.Kim-1／Tim-1 and immune cells：shifting sands［J］.Kidney Int，2012，81（9）：809－811.

［9］林瓊真，楊莉，李曉玫.腎損傷分子1及其在腎臟疾病中的研究現(xiàn)狀［J］.中華腎臟病雜志，2012，28（1）：67－71.

［10］岳華，劉紅，劉穎，等.腎損傷分子-1，尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶及尿微量白蛋白在重癥感染中合并急性腎損傷的臨床觀察［J］.國際泌尿系統(tǒng)雜志，2012，31（6）：730－732.

［11］SINHAV，VENCELM，SALAHUDEENAK.Urinary tubular protein-based biomarkers in the rodent model of cisplatin nephrotoxicity：a comparative analysis of serum creatinine，renal histology，and urinary KIM-1，NGAL，and NAG in the initiation，maintenance，and recovery phases of acute kidney injury［J］.J Investig Med，2013，61（3）：564－568.

［12］胡英華，胡紅文，趙磊.尿酶檢測在診斷早期腎臟損傷中的應(yīng)用［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（7）：849－850.

（本文編輯：趙麗潔）

CHANGE OF SERUM AND URINE BIOCHEMICAL INDEXES IN KIDNEY DAMAGE RATS WITH SEVERE ACUTE PANCREATITIS

SHEN Wei，LI Qinghuai*，LI Xiaoyu，YAN Li，ZHANG Linlei
（Department of Glands Surgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050017，China）

ObjectiveTo observe the change of serum and urine biochemical indexes in kidney damage rats with severe acute pancreatitis（SAP）.MethodsA total of 240 healthy male Sprague-Dawley rats were selected as the research objects，and the rats were randomly divided into eight groups（each group，n＝30）by random number table，named as SAP different time group（SAP 1h，3h，6h，9h，12h，18h，24h group）and the control group.The serum amylase（AMY），serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN）and blood uric acid（UA），the urine creatinine（UCr），renal injury molecules（KIM）-1 andβ-N-acetyl amino glycosidase enzymes（NAG）of different groups were compared.ResultsThe levels of SCr，BUN and UA of SAP 1h，3h，6h，9h，12h，18h，24h group were higher than those of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The UCr levels of SAP 1h，3h，6h，9h，12h group were lower than those of the control group，the levels of KIM-1 and NAG were higher than those of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionIn SAP kidney damage，the renal tubular injury is earlier than the capillary damage.The KIM-1 and NAG are therenal tubular damage judge indexes，the sensitivity and specificity were better than Cr，BUN and UA for early diagnosis of SAP kidney damage.

pancreatitis，acute necrotizing；acute kidney injury；biological markers重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）因其發(fā)病兇險(xiǎn)，病情復(fù)雜多變，常并發(fā)多臟器功能衰竭，當(dāng)病程發(fā)展為腎功能障礙后，病情變得更加復(fù)雜、危重。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于SAP并發(fā)腎損傷的研究多集中在病因及機(jī)制和針對(duì)其機(jī)制所采取的抑制炎癥細(xì)胞和炎癥因子的治療措施上［1］。但對(duì)于其發(fā)病的詳細(xì)過程還不甚明了，尤其是腎損傷病程中血清和尿液生化指標(biāo)的變化還沒有一個(gè)完整的監(jiān)測。為此，筆者認(rèn)為誘導(dǎo)建立大鼠 SAP模型，動(dòng)態(tài)觀察腎臟損傷的血清及尿液生化指標(biāo)變化趨勢并探討其發(fā)生機(jī)制，可為臨床診治提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

R576

A

1007-3205（2014）10-1117-04

2014－06－27；

2014－08－15

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（08276101D-84）

申偉（1982－），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事甲狀腺外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：liqh4011＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.001