髓性白血病骨髓單個核細胞表面CD40、CD40L的表達及其意義

馮永懷，吳柳松，方寧，馮子芳，陳琦

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液內科，貴州遵義 563003)

髓性白血病骨髓單個核細胞表面CD40、CD40L的表達及其意義

馮永懷，吳柳松，方寧，馮子芳，陳琦

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液內科，貴州遵義 563003)

目的研究共刺激分子CD40、CD40L在人急、慢性髓性白血病治療前后骨髓單個核細胞表面的表達特點，探討其與臨床療效的關系。方法應用免疫熒光標記及流式細胞術(FACS)檢測了37例急性髓性白血病及20例慢性髓性白血病患者治療前后骨髓單個核細胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表達。另取8例健康人骨髓作為正常對照組。結果①治療前急性髓性白血病(AML)患者中，除急性早幼粒細胞白血病(M 3)外，CD40表達均低于正常對照組(P＜0.05)；②治療后完全緩解(CR)和部分緩解(PR)患者CD40較其治療前顯著增高(P＜0.05)，CR患者接近對照者，而未緩解(NR)患者CD40的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；③CD40在慢性粒細胞白血病骨髓單個核細胞上的表達與正常對照差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；④所有急、慢性髓性白血病患者及正常對照骨髓單個核細胞上的CD40L均存在表達缺陷，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論CD40是參與急性髓性白血病(AML)發(fā)病和抗白血病免疫反應的重要共刺激分子，其表達與白血病分化程度及分型有關，CD40表達異常可能是AML發(fā)病機制之一，且與臨床療效密切相關；調節(jié)單個核細胞上CD40的表達，糾正AML白血病患者細胞免疫功能缺陷，可能是免疫基因治療人類急性髓性白血病的重要手段之一，具有一定的臨床應用價值。

髓性白血?。粏蝹€核細胞表面；CD40；CD40L

CD40-CD40L是繼B7-CD28后發(fā)現的又一重要的共刺激信號。CD40/CD40L交聯可活化NF-KB，進而激活磷酸酪氨酸激酶(PTK)和絲氨酸激酶，促進B細胞存活、增殖、分化。此外，二者交聯可增加Fas表達，促進Fas介導的凋亡，上調共刺激因子MHCII、CD58、CD80/CD86的表達，這使得CD40-CD40L參予的雙向T-B合作在腫瘤免疫中起著重要作用[1]。本研究應用流式細胞術，檢測了臨床常見各型白血病骨髓單個核細胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表達情況，并與正常健康對照骨髓單個核細胞相比較，以期為sCD40L用于靶向治療白血病提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料2007年1月至2009年2月遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院確診的急性骨髓性白血病(AML)患者(初治或復治)37例(男性16例，女性21例)，中位年齡34(14～68)歲，按FAB分型，并于北京海思特檢驗中心及我院流式細胞工程室進行免疫分型，其中急性早幼粒細胞白血病(M 3)10例，急性單核細胞白血病(M 5)15例，急性粒細胞白血病部分分化型(M 2)6例，其他類型AML(M-other)6例[(包括急性粒細胞白血病未分化型(M 1)、急性粒單核細胞伴嗜酸性粒細胞增多(M 4EO)、急性巨核細胞性白血病(M 7)各2例)]。均經常規(guī)聯合化療，療效標準依據參考文獻[2]。其中，完全緩解(CR)18例，部分緩解(PR)12例，未緩解(NR)7例。慢性粒細胞白血病組(CML)20例初診慢性期患者，男性12例，女性8例，中位年齡34(24～60)歲，Ph染色體均陽性。正常對照組8例，男性7例，女性1例，中位年齡30(19～35)歲，均為健康自愿者的正常骨髓。

1.2 試劑與儀器用于免疫分型的相關單克隆抗體、PE標記的抗人CD40L單抗、FITC標記的抗人CD40單抗及同型對照購自BD/Pharm ingen公司。流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.3 單個核細胞表面CD40、CD40L的檢測采用流式細胞術直接免疫熒光標記法參照此前本研究小組操作方法[3]，上流式細胞儀檢測，與對照抗體比較。結果用熒光閾值強度計算陽性細胞百分比。用Facscalibur cellquest軟件分析結果。

1.4 統(tǒng)計學方法各組計量資料數據用均值±標準差(x-±s)表示，采用SPSS16.0軟件系統(tǒng)進行分析，各組患者與正常對照組的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 髓性白血病骨髓單個核細胞CD40、CD40L的表達37例AML及20例CML患者CD40有不同程度的表達，前者與正常對照組相比較，其表達低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而后者與正常對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；所有受測白血病患者與健康志愿者骨髓單個核細胞表面CD40L表達均缺陷，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 髓性白血病骨髓單個核細胞CD40、CD40L的表達(%，±s)

表1 髓性白血病骨髓單個核細胞CD40、CD40L的表達(%，±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.05。

組別AML組CML組正常對照組CD40L 1.057±2.434 1.106±1.667 0.696±0.883例數37 20 8 CD401.549±2.771a3.793±3.220 6.875±4.124

2.2 各型AML骨髓單個核細胞CD40、CD40L的表達對不同類型的AML進行比較，發(fā)現M 2、M 5組CD40表達均低于正常對照(P＜0.05)，M 3組CD40存在一定表達，與正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；M-other組(包括M 1、M 4EO、M 7各2例)其CD40表達低于正常對照(P＜0.05)。CD40L在各型AML的表達均較低，與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各型AM L骨髓單個核細胞CD40、CD154的表達(%，±s)

表2 各型AM L骨髓單個核細胞CD40、CD154的表達(%，±s)

注：與健康對照組比較，aP＜0.05。

組別例數CD40CD40L M 3組M 5組M 2組其他類型AML正常對照組10 15 668 4.1258±2.97 1.555±2.459a0.182±0.153a0.443±0.060a6.875±4.100 1.222±1.127 1.430±0.328 0.628±1.369 0.302±0.319 0.696±0.883

2.3 化療前后AML骨髓單個核細胞CD40、CD40L的表達治療后CR和PR患者CD40較其治療前顯著增高(P＜0.05)，CR患者接近對照者，而NR患者CD40的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD40L在各組AML中的表達均較低，與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 化療前后AM L骨髓單個核細胞CD40和CD40L的表達(%，±s)

表3 化療前后AM L骨髓單個核細胞CD40和CD40L的表達(%，±s)

注：與化療前組比較，aP＜0.05。

組別CR組PR組NR組化療前組0.687±1.506 0.890±1.089 1.342±1.430 1.057±2.434 18 12 7 37 6.409±2.012a4.024±1.010a1.232±1.706 1.549±2.771 CD40L例數CD40

3 討論

CD40是NGFR超家族成員，也屬于腫瘤壞死家族成員之一，可在多種細胞表達。CD40L即CD40配體，屬于TNF超家族成員，與CD40分子相互作用，在腫瘤細胞的抗原呈遞、免疫應答反應和細胞的增殖調控方面發(fā)揮著重要作用[4]。sCD40L具有抗腫瘤效應，主要是在胃癌、肺癌等實體瘤方面研究較多。Li等[5]研究表明體外培養(yǎng)的胃癌AGS細胞株高表達CD40，利用激發(fā)型抗CD40單克隆抗體活化CD40信號可抑制AGS細胞生長、促進細胞凋亡，且顯著提高了其對化療藥物的敏感性。陳文學等[6]研究發(fā)現sCD40L對高表達CD40信號分子的肺癌A594細胞株的生長有顯著地抑制作用，提示sCD40L對高表達CD40分子的腫瘤細胞可能有一定的抗腫瘤作用。此外，sCD40L在血液系統(tǒng)疾病的研究也發(fā)現，AML患者化療后血漿sCD40L水平較化療前升高[7]。李杰等[8]的研究發(fā)現sCD40L可明顯抑制急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞的增值，其抗白血病的機制可能與上調CD95、下調BCL-2相關。

研究表明，白血病細胞可能由于存在HLA抗原及協同刺激分子的表達缺陷，而不能激發(fā)有效的T細胞應答[9]，而AL患者的白血病細胞常高表達MHC[10]，所以其表面缺乏協同刺激分子的表達可能才是AL產生腫瘤免疫逃逸的主要原因。

關于CD40、CD40L共刺激分子在AL的表達水平，我們的前期研究表明急性淋巴細胞白血病(ALL)單個核細胞表面CD40、CD40L表達缺陷[3]。而急性髓性白血病(AML)各家報道不一，朱芳兵等[11]報道AML中相當一部分存在CD40的陽性表達(37%/52%)，其中M 5的陽性率最高，高于其他AML亞型，并指出AML的臨床血液學特征與CD40表達存在相關性。而我們的結果顯示在初診白血病患者的骨髓單個核細胞上，CD40除了在ALL單個核細胞表面表達缺陷[3]，在除了M 3以外的AML表達也都是低于正常對照組。CD40和CD40L表達各家報道不一，除了與各家制定的陽性表達的標準不同，采用的正常對照的標準不同，以及共刺激分子的在標本采集時機不同以外[12]，不同類型或亞型白血病細胞上共刺激分子的表達本身亦存在一定異質性可能也是一個主要原因。從我們的實驗結果分析，CD40在AL患者骨髓單個核細胞表面表達缺如，這導致CD40-CD40L共刺激信號中斷，致使T細胞無法識別TCR抗原，CTL就無法對白血病細胞進行識別及殺傷。此外其他共刺激分子如B7、粘附分子如ICAM-1的表達以及IL-12、INF-γ等效應性細胞因子的分泌都會因CD40的表達缺乏而受到影響，從而使機體抗白血病免疫防御能力下降。CD40-CD40L因為與凋亡相關基因如survivine、c-myc、hTERT等有著密切的聯系，還可誘導白血病細胞凋亡[13]，CD40-CD40L信號途徑的中斷勢必由此影響白血病細胞的凋亡。

CD40-CD40L配基化作用的下游信號可能參與抗凋亡基因survivinmRNA的轉錄?，F認為腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)是介導CD40分子信號傳遞的中心分子，其中活化的NF-κB能夠有效誘導Survivin基因表達。CD40表達缺陷可能由此影響白血病細胞凋亡程序參與CD40陰性表達AL的發(fā)生發(fā)展。AML-M 3及CM L存在一定數量的CD40表達，可能還與它具有相對獨立的發(fā)病機制，使AML細胞逃避更為復雜的免疫監(jiān)視有關。此外，我們也發(fā)現，未治療的初診AML患者(除M 3外)，CD40表達缺陷，當化療達完全緩解及部分緩解后，CD40的表達升高，表明CD40的檢測可能作為評估AML(除M 3外)療效的一項指標。

我們的結果顯示健康對照組和各型白血病組骨髓單個核細胞表面CD40L的表達均為陰性，這與師帥帥等[14]的研究結果也存在差異，他們的研究表明部分白血病不僅單獨表達CD40，也合并表達CD40L，CD40與 CD40L與高白細胞計數、低血小板數、脾大等臨床表現有相關性。存在這樣的差異可能與CD40L主要表達在激活的T細胞，且表達具有瞬時性[15]有關。

目前除了骨髓移植及化療外，腫瘤免疫治療是白血病治療的另一主要努力方向。為設計高效的白血病免疫治療方案，可上調HLA抗原及協同刺激分子在白血病細胞表面的表達，從而提高白血病細胞的抗原遞呈能力。我們的初步研究表明CD40表達缺陷與AL白血病細胞的免疫逃逸可能有關，期望能對CD40陰性表達AL的免疫治療提供實驗依據。

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Expression of CD40,CD40L on mononuclear cells surface of myeloid leukemia and it sclinical significance.

FENG Yong-huai,WU Liu-song,FANGNing,FENG Zi-fang,CHEN Qi.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College,Zunyi563003,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the expression characteristics of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cells in human acute and chronicm yeloid leukem ia before and after the chemotherapy,and to explore their significance in antileukem ia immunity.MethodsThe expression of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cellswasmeasured in 37 patientsw ith acutemyeloid leukem ia(AML group)and 20 patientsw ith chronicmyeloid leukem ia(CML group)before and after chemotherapy by immunofluorescence and FACS. TheResultswere compared w ith eight casesof healthy bonemarrow(the controlgroup).Results①The levelof CD40in AML group except forM 3 before chemotherapy was significantly lower than those in the controlgroup(P＜0.05).②The levelof CD40increased in complete rem ission(CR)and partial rem ission(PR)patientsafter chemotherapy compared w ith that before chemotherapy(P＜0.05).The level in CR patientswas close to that in the control.No significant change was found in nonrem ission(NR)patients(P＞0.05).③The level of CD40in CML patientswas close to that in the control,No significant changewas found in CML patients(P＞0.05).④Moreover,the CD40L are deficient in BMMC of all cases,including AML,CML and healthy volunteers(P＞0.05).ConclusionCD40are important costimulatorymolecules during the pathogenesis and antileukem ia immunity of AML.The level of CD40may be related to differentiated degree and classification ofmyeloid leukema.Their abnormal levelmay partly be responsible for the pathogenesis of AML and be closely related w ith the clinical curative effects.Itmay be one of importantmeans to treathuman acute myeloid leukem ia immunogenetically by regulating theexpression of CD40inmononuclear cellsand by correcting the immunodeficiency of AML patients.

M yeloid leukem ia;M ononuclear cell surface;CD40;CD40L

R733.7

A

1003—6350（2014）04—0523—03

2013-07-11)

貴州省科學技術基金項目(編號：黔科合丁字[2006]2071號)

陳琦。E-mail:zyfychenqi@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0201