胰腺癌細胞BXPC-3轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

卜海激，王毛毛

·論著·

胰腺癌細胞BXPC-3轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

卜海激，王毛毛

目的 探討實驗室常用的人胰腺癌細胞株BXPC-3的有效轉(zhuǎn)染方法及最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)。方法 通過脂質(zhì)體法和電穿孔法將表達綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(pGFP-N3)導(dǎo)入人胰腺癌細胞株BXPC-3中，24 h后觀察并比較細胞的存活率及瞬轉(zhuǎn)效率，確定最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)。結(jié)果 常規(guī)脂質(zhì)體法BXPC-3細胞瞬轉(zhuǎn)陽性率為1.36%，細胞存活率為87.45%;而電穿孔法在電壓120 V電擊時程70μs條件下，BXPC-3細胞瞬轉(zhuǎn)陽性率為54.78%，細胞存活率為64.01%，2種轉(zhuǎn)染方法的瞬轉(zhuǎn)陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 轉(zhuǎn)染BXPC-3細胞，電穿孔法可取得比常規(guī)脂質(zhì)體法更高的轉(zhuǎn)染效率。通過條件的優(yōu)化，電穿孔法可以用于某些脂質(zhì)體法難以有效轉(zhuǎn)染的細胞株。

細胞轉(zhuǎn)染;電穿孔法;脂質(zhì)體法;胰腺癌

近年來，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。其中脂質(zhì)體法因高效、操作簡便、適用的細胞多而被廣泛應(yīng)用［1］。電穿孔方法則是利用細胞膜的保守特性，用高于某一閾值的外加瞬間脈沖電場作用于受體細胞，改變細胞膜結(jié)構(gòu)，在細胞膜形成暫時性納米大小的孔隙，從而將外源基因?qū)爰毎?，具有操作簡便快捷、可重?fù)性強、轉(zhuǎn)染率高、適用譜廣等優(yōu)越性，尤其對一些較難轉(zhuǎn)染的細胞亦能獲得較高的轉(zhuǎn)染率［2］。但由于電穿孔法轉(zhuǎn)染效率受多種因素的影響，針對特定細胞系的最佳轉(zhuǎn)染條件必須進行個別優(yōu)化，從而限制了電穿孔法的應(yīng)用。目前關(guān)于胰腺癌細胞株的電穿孔法參數(shù)設(shè)置和技巧罕見報道。本實驗中筆者通過脂質(zhì)體法及電穿孔法轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的人胰腺癌細胞BXPC-3，以綠色熒光蛋白(pGFP-N3)為報告基因，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和參數(shù)，探討B(tài)XPC-3的有效轉(zhuǎn)染方法和最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 電穿孔儀器(ECM 830)購自美國BTX公司，電轉(zhuǎn)槽由電穿孔儀器所配套提供;電轉(zhuǎn)杯為一次性2 mm杯，購自Eppendorf公司; Lipofectamine TM2000、G418及DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒和細胞株 大腸桿菌DH5a、質(zhì)粒pGFP-N3、人胰腺癌細胞株BXPC-3、人腎上皮細胞株293T均為本實驗室保存。BXPC-3用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng);293T細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細胞生長至70%～80%融合度時用含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，進行傳代。質(zhì)粒pGFP-N3在大腸桿菌DH5a中按常規(guī)方法增殖和篩選。轉(zhuǎn)染pGFP-N3質(zhì)粒后的細胞48 h后用G418篩選抗性克隆。

1.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 取細胞培養(yǎng)用6孔板，轉(zhuǎn)染前24 h用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化對數(shù)生長期的BXPC-3細胞，以1×106個細胞/孔鋪板，轉(zhuǎn)染前1 h更換不含血清的DMEM培養(yǎng)基;取綠色熒光蛋白質(zhì)粒 PGFP-N 310μg，加不含血清的DMEM補充至250μl，充分混勻，室溫孵育10 min;取脂質(zhì)體10μl加入不含血清的DMEM補充至250μl，充分混勻，室溫下孵育5 min;將配置好的含質(zhì)粒DMEM加入到含脂質(zhì)體的DMEM中，充分混勻;室溫靜置20 min，加入無血清培養(yǎng)基至1 m l; 6孔板每孔加轉(zhuǎn)染液1 ml，十字方向混勻，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng);以高轉(zhuǎn)染效率的293T細胞同步轉(zhuǎn)染作為陽性對照，以空白載體pcDNA3.1替代PGFP-N3同步轉(zhuǎn)染作為陰性對照。24 h熒光顯微鏡下觀察。

1.4 電穿孔轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的BXPC-3細胞，離心沉淀;重懸于PBS中，細胞密度調(diào)至2.5× 106～2.5×107個/m l，轉(zhuǎn)移400μl細胞懸液至電轉(zhuǎn)杯中，將之放在冰上。設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)，在正式電穿孔前用含PBS的空電轉(zhuǎn)杯通電2次。細胞懸液中加入10～30μg PEGFP-N3質(zhì)粒，體積＜40μl，混勻。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中，電擊前后冰浴10 min，電擊后將細胞放入培養(yǎng)皿中加完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h熒光顯微鏡下觀察。

1.5 細胞存活率和轉(zhuǎn)染陽性率觀察 轉(zhuǎn)染后臺盼蘭染色計數(shù)細胞存活率。24 h后在倒置熒光顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野發(fā)出綠色熒光的細胞，計數(shù)瞬時轉(zhuǎn)染陽性率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。每組試驗設(shè)置3組重復(fù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BXPC-3細胞結(jié)果 293T細胞為脂質(zhì)體法高轉(zhuǎn)染率細胞，采用293T作為實驗陽性對照組。結(jié)果顯示293T脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后細胞存活率為93.65%，瞬轉(zhuǎn)陽性率為89.23%(圖1A、B);而同步轉(zhuǎn)染的BXPC-3細胞存活率為87.45%，瞬轉(zhuǎn)陽性率僅為1.36%(圖1C、D);提示常規(guī)脂質(zhì)體法BXPC-3細胞轉(zhuǎn)染效果欠佳。筆者通過血清饑餓、甘油/二甲亞砜休克法、增加脂質(zhì)體孵育時間及濃度等方法試圖提高轉(zhuǎn)染效率，均未明顯提高轉(zhuǎn)染效率(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 電穿孔法轉(zhuǎn)染BXPC-3細胞結(jié)果 電穿孔法顯示對BXPC-3細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率(圖1E、F)。設(shè)置電壓參數(shù)時發(fā)現(xiàn)，隨著電壓由80 V至200 V逐漸增加，BXPC-3細胞存活率逐漸下降;瞬轉(zhuǎn)陽性率則是開始隨電壓增加而增高，在120 V時達到峰值，而后陽性率又逐漸降低(圖2)。電擊時程(pulse length)對轉(zhuǎn)染影響顯示，隨時程延長，細胞存活率略有降低，而轉(zhuǎn)染陽性率則逐步增加，至70μs時獲得最高的轉(zhuǎn)染效率(圖3)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，在電壓120 V，脈沖時間70μs時轉(zhuǎn)染細胞的存活率為64.01%，滿足實驗存活細胞的基本要求。而瞬轉(zhuǎn)陽性率為54.78%，與常規(guī)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BXPC-3細胞的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 25.94，P＜0.05);提示電穿孔法對脂質(zhì)體法難轉(zhuǎn)的BXPC-3細胞有較好的轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染后再通過G418抗性篩選可獲得穩(wěn)定表達pGFP的BXPC-3細胞株。

圖1 光鏡及熒光倒置顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率

圖2 電壓對細胞存活率和轉(zhuǎn)染陽性率的影響

圖3 電擊時程對細胞存活率和轉(zhuǎn)染陽性率的影響

3 討論

近年來各種脂質(zhì)體法快速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于多種細胞的基因轉(zhuǎn)染。然而有些懸浮細胞［3］及本實驗中的BXPC-3細胞等，使用常規(guī)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率低;某些細胞如血細胞及肝細胞等［4］對脂質(zhì)體法的細胞毒性敏感，轉(zhuǎn)染后細胞存活率低。此時與常規(guī)脂質(zhì)體相比，電穿孔法具有重復(fù)性強、安全性高等優(yōu)點，通過調(diào)整電轉(zhuǎn)參數(shù)的設(shè)置能獲得良好的轉(zhuǎn)染效果［5-7］。

本實驗用脂質(zhì)體法和電穿孔法2種方法將pGFP-N3綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞株BXPC-3，檢測瞬時轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)常規(guī)脂質(zhì)體法和電穿孔法轉(zhuǎn)染效率有明顯差異，電穿孔法對脂質(zhì)體法難轉(zhuǎn)的BXPC-3細胞有較好的轉(zhuǎn)染效率。

影響電穿孔轉(zhuǎn)染率和細胞存活率的因素很多，如電擊電壓、電擊時程、電擊次數(shù)、溫度、緩沖液成分、細胞狀態(tài)和體積、質(zhì)粒的濃度和構(gòu)象等，因此特定細胞系的最佳轉(zhuǎn)染條件必須進行個別優(yōu)化［8-9］。

轉(zhuǎn)染細胞的狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)染率的重要原因。處于對數(shù)生長期的細胞增殖速度快，細胞表面結(jié)構(gòu)致密度比穩(wěn)定期的細胞差，電穿孔后受體細胞膜的恢復(fù)能力較強，其轉(zhuǎn)染率和存活率都比生長過老的細胞高。Takahashi等［10］通過增加S期細胞的比例提高了電穿孔轉(zhuǎn)染率，提示細胞狀態(tài)和細胞周期能對電穿孔效率起很重要的作用。沈慧玲等［11］亦證實，對數(shù)生長期的白血病細胞轉(zhuǎn)染率是生長過老細胞的近10倍，而存活率較后者高r倍左右，表明取對數(shù)生長期的細胞進行電穿孔轉(zhuǎn)染可明顯提高轉(zhuǎn)染率。

轉(zhuǎn)染緩沖液成分對轉(zhuǎn)染率也有一定的影響。血清被認為是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。在多種脂質(zhì)體中，血清的存在可降低脂質(zhì)體的細胞毒性作用，使細胞轉(zhuǎn)染的存活率升高。但同時血清可干擾脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物的能力從而降低細胞轉(zhuǎn)染率。因此目前脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染中較為廣泛應(yīng)用的是不含血清的磷酸緩沖液或低滲轉(zhuǎn)移緩沖液。血清成分的缺乏是導(dǎo)致脂質(zhì)體法細胞毒性作用大的一個重要因素，從而限制了脂質(zhì)體法在部分細胞的應(yīng)用。而電穿孔轉(zhuǎn)染法中，常用的電轉(zhuǎn)液為低滲及高導(dǎo)電性的轉(zhuǎn)移緩沖液，如PBS及標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。Miyahara等［12］實驗證明，使用0.77 mol/L的甘露醇溶液可以完全替代 IMK成分培養(yǎng)基，兩者的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異。

電擊電壓和電擊時程參數(shù)的設(shè)置是電穿孔實驗成敗的關(guān)鍵［13］。在本實驗中，筆者針對人胰腺癌細胞株BXPC-3電穿孔電壓和時程參數(shù)進行了摸索，首先設(shè)定了電壓參數(shù)。電壓太低時，電擊穿孔條件不充分，則轉(zhuǎn)染率不高;如果電壓過高，則細胞損傷重，電轉(zhuǎn)后存活率低，同樣影響轉(zhuǎn)染率。電壓參數(shù)可根據(jù)電轉(zhuǎn)細胞的直徑作粗略的估計，細胞越大所需的電壓越小。筆者通過在電轉(zhuǎn)液中懸浮細胞10～20 min后測量細胞直徑獲得電轉(zhuǎn)電壓的粗略值。然后在80～200 V之間調(diào)整電壓，在120 V時獲得較高的轉(zhuǎn)染率以及較滿意的細胞存活率。電擊時程和電壓一起維持電擊孔隙的形成，可根據(jù)波形為方形波或者呈指數(shù)衰減型波設(shè)置參數(shù)。常規(guī)在10～200μs之間。電擊時程為10～70μs時，隨電擊時程增加，電擊瞬轉(zhuǎn)效率逐步增加。70μs時瞬轉(zhuǎn)率最高，而后瞬轉(zhuǎn)陽性率又逐步下降。因此筆者認為，電壓120 V、電擊時程70μs時為最佳的電轉(zhuǎn)參數(shù)，此時電轉(zhuǎn)的瞬轉(zhuǎn)陽性率為54.78%，細胞存活率為64.01%，明顯優(yōu)于常規(guī)脂質(zhì)體法的陽性率1.36%。

本實驗成功電轉(zhuǎn)胰腺癌細胞株BXPC-3細胞，為實驗中利用BXPC-3細胞進行各種基因研究提供了實驗基礎(chǔ)，也為實驗室其他細胞電擊參數(shù)的設(shè)置和技巧提供了參考。

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Optim ization of transfection conditions for human pancreatic cancer cell line BXPC-3

BU Hai-ji，WANGMao-mao

(Department of Pathology，No.455 Hospital of CPLA，Shanghai200052，China)

Objective To investigate transfectionmethods and conditions for human pancreatic cancer cell line BXPC-3 and related optimal transfection data.Methods The plasm pGFP-N3 was transfected into BXPC-3 cells respectively by lipofectamine 2000 and electroporation.Then，survival and transient transfection rates of the cells were observed and compared after 24 hours，so as to identify the optimal transfection data.Results The positive BXPC-3 transient transfection efficiency by lipofectamine 2 000 was 1.36%，with the cell survival rate of 87.45%，while the transient transfection efficiency by electroporation with the pulse length of70 μs and electric shock of 120 V was 54.78%，with the cell survival rate of 64.01%.Statistics indicated that there were significant differences in the transient transfection rates，when comparisons weremade between the 2 transient transfection methods(P＜0.05).Conclusion In the transfection of BXPC-3，electroporation could achieve higher transfection rates than the conventional lipofectamine.Through optimization of transfection conditions，electroporation could effectively transfect certain cell strains，which were hard to be transfected by lipofectamine.

Cell transfection;Lipofectamine;Electroporation;Pancreatic cancer

R735.9

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.002

2014－01－20)

(本文編輯:林永麗)

200052 上海，解放軍第四五五醫(yī)院(卜海激);解放軍第四一一醫(yī)院(王毛毛)

王毛毛，電子信箱:mm1b@sina.com