血管內皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞對慢性腎衰竭大鼠血管新生的影響

崔 炯，鄧金秀，萬建新

·論著·

血管內皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞對慢性腎衰竭大鼠血管新生的影響

崔 炯，鄧金秀，萬建新

目的 探討血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因轉染骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠腎小球內皮細胞修復和血管新生的影響。方法 體外分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，Ad5-hVEGF-EGFP轉染MSCs并觀察轉染對細胞增殖，分泌VEGF的影響。50只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為假手術組、慢性腎衰竭組、MSCs移植組、Ad-VEGF注射組和VEGF基因轉染的MSCs移植組，每組10只。采用分階段5/6腎切除術制備大鼠慢性腎衰竭動物模型。假手術組與慢性腎衰竭組于切除右腎之前從該側腎動脈注射不含血清的改良杜氏伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液，其余3組分別給予MSCs，Ad-VEGF和VEGF基因轉染的MSCs。8周后檢測各組大鼠腎功能，并用免疫組化檢測腎小球CD31表達情況。結果 Ad5-hVEGF-EGFP轉染后對MSCs細胞增殖無影響，轉染后分泌VEGF蛋白較空質粒轉染組明顯增加(P＜0.05)。MSCs移植組和VEGF基因轉染的MSCs移植組血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)均較慢性腎衰竭組降低(P＜0.05);與MSCs移植組比較，VEGF基因轉染的MSCs移植組Scr和BUN降低更顯著(P＜0.05)。慢性腎衰竭組腎小球中CD31表達較假手術組顯著降低(P＜0.05)，應用MSCs和VEGF165基因轉染的MSCs干預后腎小球中CD31表達有所增加，VEGF基因轉染的MSCs組增加更明顯(P＜0.05)。結論 慢性腎衰竭大鼠給予轉染VEGF基因的MSCs移植后毛細血管內皮細胞數量增多，腎臟功能改善;其作用可能與基因轉染增加VEGF表達及有利于腎小球毛細血管內皮修復、血管新生有關。

血管內皮細胞生長因子;骨髓間充質干細胞;慢性腎衰竭;大鼠;血管新生

腎小球毛細血管網的毀損及后續(xù)的血管新生修復反應不全，是慢性進展性腎臟病的顯著特征，并將導致腎小球硬化的發(fā)生［1］。國外研究表明，骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能促進腎臟血管新生和內皮細胞修復［2］。Okuyama等［3］的研究認為MSCs在轉化為血管內皮樣細胞的過程中局部血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激起了重要作用。由于VEGF生物半衰期短，注入體內易稀釋，故外源給予VEGF蛋白誘導分化效力有限，而基因治療有望克服此缺陷。MSCs可接受多種載體的基因轉染并在體內分化后保持良好的遺傳穩(wěn)定性，細胞治療結合基因治療已證實對多種動物模型有效促進血管再生作用，但對慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠的影響尚未有研究報道。本研究在體外構建重組VEGF腺病毒質粒轉染MSCs并經腎動脈移植，探討對慢性腎衰竭大鼠腎功能和腎小球內皮細胞修復和血管新生的影響，旨在為慢性腎衰竭的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

3周齡雄性清潔級SD大鼠50只，用于MSC的分離及培養(yǎng)(由吳氏實驗動物中心提供)，體質量50～100 g。8周齡雄性清潔級SD大鼠50只(由吳氏實驗動物中心提供)，體質量150～200 g，按數字表法隨機分為5組，每組10只，分別為:假手術組(組Ⅰ)、慢性腎衰竭組(組Ⅱ)、MSCs移植組(組Ⅲ)、Ad-VEGF注射組(組Ⅳ)和VEGF基因轉染的MSCs移植組(組Ⅴ)。

1.2 藥品與試劑

Ad5-hVEGF-EGFP(北京本元正陽基因技術有限公司)、胎牛血清(Gibco，USA)、DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco，USA)、CD 31單克隆抗體(Abcam，英國)、抗大鼠VEGF(Abcam，英國)、大鼠VEGF ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)。

1.3 方法

1.3.1 MSC的分離、培養(yǎng)與VEGF基因轉染 3周齡雄性SD大鼠(由吳氏實驗動物中心提供)，體質量50～100 g。頸椎脫臼法處死大鼠，獲得其長骨骨髓液，1 500×g離心5min，棄上清，用15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞。轉移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，放37℃、5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，長至80%～90%融合時用0.125%胰酶消化l:3傳代細胞。取生長狀態(tài)良好的3代MSCs，融合至60%，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓12 h后換成15%胎牛血清的DMEM/F12，同時按照細胞與Ad-hVEGF-EGFP質粒=1∶100進行共培養(yǎng)，24、48和72 h熒光顯微鏡下觀察轉染率。

1.3.2 噻唑藍(MTT)法檢測細胞的增殖 取對數生長期的MSCs按每孔104個細胞/ml接種于96孔板，用15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃，5%CO2孵育，細胞長至60%～70%融合后，按照前述方法對細胞進行轉染，濃度設6個復孔。轉染成功后每個孔加入10μl新鮮配制的MTT溶液(5 mg/ ml)，孵育4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜，振蕩5 min后，490 nm處讀取光密度(OD)值。實驗重復3次，取平均值。同時設置空質粒轉染組作為對照。

1.3.3 細胞上清的收集及外分泌VEGF的ELISA法檢測 轉染后第4、7、10、14天收集上清并保存于－70℃待檢，酶標儀測各組VEGF蛋白濃度。

1.3.4 動物模型制備及分組干預 采用分階段5/6腎切除制備大鼠慢性腎衰竭模型:10%水合氯醛腹腔麻醉后，經側腹部切口，暴露左側腎臟，分離腎動脈及其分支，結扎其中的左上支和中支并剪斷，使左腎梗死約2/3，3 d后再將大鼠右腎摘除。假手術組僅分離腎動脈及其分支，不予結扎，3 d后同期手術，但僅剝離右腎包膜暴露腎臟后關腹。長至90%的Ad-VEGF-GFP的 MSCs用0.125%胰酶消化，并對其進行細胞計數，用無血清的DMEM/F12重懸細胞至1×106個/m l。VEGF基因轉染的MSCs移植組注入1×106個MSCs/Ad-VEGF，MSCs移植組注入1×106個MSCs，Ad-VEGF組注入VEGF基因質粒，假手術組與慢性腎衰竭組注入不含血清的DMEM培養(yǎng)液。均于切除右腎之前從該側腎動脈注射，注射量1 ml。所有大鼠均于造模后8周處死。

1.3.5 大鼠腎功能檢測 處死大鼠時經心臟取血2 ml，用全自動生化分析儀測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)。

1.3.6 免疫組織化學及半定量檢測CD31表達2μm的石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，滴加3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗，加入適當比例稀釋的一抗50μl，37℃孵育1 h，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。鏡下觀察染色情況，蒸餾水及時終止反應，自來水沖洗5 min;蘇木素淡染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性反應物部位呈棕色，細胞核呈淡藍色。在400倍的顯微鏡視野下，每張切片于皮髓質交界處隨機取5個不重復視野的腎小球，由攝像系統(tǒng)提取數據化病理圖象，輸入圖像分析系統(tǒng)Motic Images Advanced進行光密度(OD)值計算，取平均OD值進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，多組間比較經方差齊性檢驗再進行方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

8周顯示造模成功，表現為慢性腎衰竭組BUN、Scr較假手術組明顯升高，病理示腎小球毛細血管塌陷，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹及脫落。成功率100%。

2.1 MSCs形態(tài)特征

大鼠MSCs在24 h就可以見到細胞貼壁，隨著時間的推移細胞呈梭形，三角形，最后成片狀，4 d后可以鋪滿瓶底，傳代之后細胞呈長梭形或者纖維狀，細胞折光性增強。

2.2 VEGF基因轉染

將攜帶綠熒光蛋白的Ad5-hVEGF-EGFP按細胞:Ad5-hVEGF-EGFP為 1∶100轉染 3～5代的MSCs。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察，見少量MSCs出現綠色熒光;轉染3d后MSCs基本全部表達綠熒光蛋白，顯示轉染效率較高。見圖1。

圖1 VEGF基因轉染MSCs(DAB染色 ×100)

2.3 轉染對MSCs活性的影響

轉染對細胞增殖沒有明顯影響，見圖2。

圖2 MTT法檢測轉染對細胞活性的影響

2.4 細胞上清VEGF的表達

VEGF基因轉染組表達明顯高于空質粒轉染組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨培養(yǎng)時間的延長量漸升高，4～7 d至高峰，后逐漸降低。見圖3。

圖3 轉染后上清中VEGF的累積濃度

2.5 各組腎功能的變化

于5/6腎大部切除術后8周檢測各組大鼠腎功能，結果顯示慢性腎衰竭組Scr和BUN均較假手術組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與慢性腎衰竭組比較，注射MSCs和VEGF基因轉染的MSCs干預后Scr和BUN均較慢性腎衰竭組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，單純Ad-VEGF干預組未顯示降低，差異無統(tǒng)計學意義。與MSCs組比較，VEGF基因轉染的MSCs移植組Scr和BUN降低更顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞對慢性腎衰竭大鼠腎功能的影響(±s)

表1 VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞對慢性腎衰竭大鼠腎功能的影響(±s)

注:與假手術組比較aP＜0.05;與慢性腎衰組比較bP＜0.05;與MSCs移植組比較cP＜0.05。VEGF為血管內皮生長因子，MSCs為骨髓間充質干細胞

組別 鼠數 肌酐(μmol/L) 尿素(mmol/L) 10 15.65±0.41 5.37±0.78慢性腎衰竭組 10 110.23±23.35a18.24±2.14aMSCs移植組 10 78.56±16.22ab14.77±2.06abAd-VEGF注射組 10 107.17±18.57a18.54±3.57aVEGF基因轉染的MSCs移植組 10 64.37±9.56abc11.43±2.95假手術組abc

2.6 各組腎小球CD31表達

慢性腎衰竭組腎小球中CD31表達較假手術組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，應用MSCs和VEGF基因轉染的MSCs干預后腎小球中CD31表達有所增加，VEGF基因轉染的MSCs組增加更為明顯(P＜0.05)。而單純Ad-VEGF干預組未顯示出明顯增加(圖4)。半定量分析計算的IOD值(圖5)。

3 討論

腎臟內皮功能紊亂、內皮細胞凋亡增加、微血管網減少與腎小球硬化及間質纖維化直接相關。在殘余腎模型中，腎小球毛細血管數目隨內皮細胞凋亡而進行性減少［4］。MSCs是一種具有多項分化潛能的多能干細胞，不僅能分化成內皮細胞，形成新生血管，而且還可上調促血管生長因子的表達，分泌多種細胞因子，如VEGF等［5］，促進MSCs遷移、分化和血管新生［6］。VEGF是存在于血管內皮細胞的特異性促血管生長因子，對血管內皮細胞有強烈的促分裂、趨化、再生和修復的作用。轉染VEGF基因的MSCs能分化為形成血管的細胞［7］。以VEGF和MSCs為基礎的基因－細胞聯合治療，有望為血管再生和損傷腎臟組織修復提供應用前景。

本研究采用攜帶VEGF基因的重組腺病毒轉染MSCs，倒置相差共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現其轉染率較高。ELISA法檢測外發(fā)現分泌VEGF蛋白的表達較空質粒轉染組明顯升高，并且細胞生長未受到影響，提示VEGF轉染有效且轉染后不影響MSCs的增殖并分泌VEGF，轉染的腺病毒并不影響細胞的活性。MSCs具備較強的增殖能力，易于轉染外源性基因且有較高的轉染率，可作為基因治療的靶細胞。

圖4 VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞對CRF大鼠腎組織CD31表達的影響(免疫組織化學染色 ×400)

圖5 VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞對各組大鼠腎組織CD31表達的影響

CD31是表達于血管內皮細胞表面的抗原，是檢測血管內皮細胞的常用標志物。本研究發(fā)現慢性腎衰竭組腎小球中CD31表達明顯降低，應用MSCs和VEGF基因轉染的MSCs干預后表達增加，VEGF基因轉染的MSCs組增加更為明顯。研究證實殘腎內皮細胞減少，毛細血管毀損，MSCs移植促進腎臟內皮細胞修復;而VEGF基因轉染的MSCs移植修復腎小球毛細血管內皮細胞數量及增加毛細血管密度效果更為顯著。VEGF直接特異地促進血管內皮細胞的增殖和遷移，促進側支血管的形成［8］;有研究表明剔除VEGF基因片段的MSCs的腎臟保護作用明顯下降［9］。因此，筆者推測VEGF轉染MSCs后仍可以保持其干細胞的多向分化潛能;同時表達VEGF增加，通過自分泌和旁分泌功能，創(chuàng)造了有利于MSCs向血管內皮樣細胞分化的微環(huán)境，這種正反饋作用促進了血管內皮細胞增殖分化和血管新生。

Yuan等［10］將VEGF基因轉染至人胚胎間充質干細胞，再通過尾靜脈輸入順鉑誘導的急性腎損傷小鼠模型后發(fā)現，VEGF-MSCs對腎臟的保護作用優(yōu)于單純的MSCs，腎臟功能和結構的損傷明顯改善。筆者研究發(fā)現 MSCs移植組、VEGF基因轉染的MSCs移植組腎功能均較慢性腎衰竭組、單純Ad-VEGF干預組改善;VEGF基因轉染的MSCs移植組改善更明顯。而單純基因干預組腎功能及腎血管內皮細胞減少均無明顯改善，分析原因殘腎組織存活細胞數量減少，單純基因轉染缺乏有效的反應靶細胞。而攜帶VEGF基因的重組腺病毒轉染MSCs的基因－細胞聯合治療既提供了外源性細胞補充，又能高效表達VEGF，對促進腎小球毛細血管內皮細胞新生和損傷腎臟修復較單純干細胞顯示出更大的優(yōu)越性。

綜上所述，Ad-VEGF能有效轉染MSCs，慢性腎衰竭大鼠給予轉染VEGF基因的MSCs移植后腎小球毛細血管內皮細胞數量增多，腎臟功能改善;較單純MSCs移植療效更為顯著。其作用可能與基因轉染增加VEGF表達，有利于腎小球毛細血管內皮修復、血管新生有關。以VEGF和MSCs為基礎的基因－細胞聯合介入治療，為血管再生和損傷腎臟組織修復和血管再生方面顯示了良好的應用前景?；蜣D染的MSCs在體內是否還可以通過轉分化機制修復慢性腎衰竭大鼠腎臟損害，還需要熒光組化等方法觀察MSCs向血管內皮細胞的分化情況。

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Effects of bone marrow mesenchymal stem cell gene transfection by VEGF gene on angiogenesis in rats with chronic renal failure

CUIJiong，DENG Jin-xiu，WAN Jian-xin

(First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China)

Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cell(MSCs)gene transfection by VEGF (vascular endothelial growth factor)gene on the repair of glomerular endothelia and angiogenesis in ratswith chronic renal failure(CRF).Methods MSCs isolated from rat bone marrow were cultured and transfected with recombinant Ad5-hVEGF-EGFP.Then，effects of transfection on cell proliferation and secretion of VEGF were observed closely.Fiftymale SD ratswere randomly divided into5 groups:the sham operation group，the CRF group，the MSCs transplantation group，the Ad-VEGF injection group and the MSCs transfected by VEGF gene group.The animal CRFmodelwas established by a two-stage5/6 nephrectomy procedure in rats.For the animals of the sham operation group and the CRF group，DMEM culture solution without serum was injected through the right renal artery prior to nephrectomy of the right kidney.The animals of the other3 groupswere treated with MSCs，Ad-VEGF and MSCs transfected by VEGF genes.After8 weeks，the renal function ofall the groupswas detected and CD31 expression in glomeruluswasmeasured by immunohistochemistry.Results The effect of Ad5-hVEGF-EGFP on the proliferation ofMSCs could notbe detected after transfection.The level of VEGF protein in supernatantafter VEGF gene transfection was significantly higher than that of the control group(P＜0.05).The Scr and BUN levels in the MSCs transplantation group and the MSCs transfected by VEGF gene group were lower than those of the CRF group(P＜0.05).As compared with those of the MSCs transplantation group，the levels of Scr and BUN for the MSCs transfected by VEGF gene group were even lower (P＜0.05).CD31 expression in glomerulus for the CRF group was decreased，as compared with thatof the sham operation group(P＜0.05).However，CD31 expression in glomerulus was increased to some extent following treatment by MSCs or MSCs transfected by VEGF gene(P＜0.05).CD31 expression level was increased more significantly for the MSCs transfected by VEGF gene group(P＜0.05).Conclusion The number of capillary endothelia was increased and renal function improved，following transplantation ofMSCs transfected by VEGF gene in ratswith chronic renal failure，whichmightbe associated with the increased expression of VEGF gene after gene transfection，its beneficial effect on the repair of glomerular capillary endothelia and angiogenesis aswell.

Vascular endothelial growth factor;Mesenchymal stem cells;Chronic renal failure;Rat;Angiogenesis

R692.5

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.001

2014－08－07)

(本文編輯:莫琳芳)

福建省自然科學基金資助項目(2012J01343)

350005 福州，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科

萬建新，電子信箱:wanjx@263.net