液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中5種苯并咪唑類殺菌劑

壽林飛，楊 挺，徐 堅(jiān)，朱 勇，趙 健，章 豪，吳銀良?

（1.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州 310020；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040；3.仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江仙居 317300）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中5種苯并咪唑類殺菌劑

壽林飛1，楊 挺2，徐 堅(jiān)3，朱 勇2，趙 健2，章 豪2，吳銀良2?

（1.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州 310020；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040；3.仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江仙居 317300）

試驗(yàn)建立了草莓、葡萄和蘋果中5種苯并咪唑類殺菌劑（多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、硫菌靈和苯菌靈）的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用乙腈提取和無水硫酸鎂鹽析后，上清液直接用0.1%甲酸溶液稀釋40倍后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，外標(biāo)法定量。各峰面積與樣品濃度在2×10－5～0.075mg·L－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)＞0.999。添加濃度0.01～5.0mg·kg－1，5種殺菌劑的平均添加回收率75.0%～95.0%，變異系數(shù)2.0%～5.0%。多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、硫菌靈和苯菌靈在實(shí)際樣品的定量限分別為0.005，0.002，0.01，0.01和0.005mg·kg－1。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；苯并咪唑類殺菌劑；水果

苯并咪唑類（benzimidazoles）殺菌劑是以有殺菌活性的苯并咪唑環(huán)為母體的一類有機(jī)殺菌劑。在農(nóng)業(yè)上可防治麥類黑穗病、赤霉病、水稻稻瘟病、紋枯病、瓜類白粉病、炭疽病、灰霉病和花卉病害等多種真菌病害，效果顯著。代表性的苯并咪唑類殺菌劑有苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈以及噻菌靈等。目前該類藥物在生產(chǎn)上仍廣泛使用，但由于苯并咪唑殺菌劑在試驗(yàn)動物和靶動物中顯示致畸和致突變作用，且在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物亦有毒理作用［1］，是食品殘留的監(jiān)控對象。

目前對于蔬菜和水果中苯并咪唑類殺菌劑的分析方法較多，其中應(yīng)用最多的是液相色譜法（LC）［2－8］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）［9－11］。由于液液分配、固相萃取等樣品凈化方式費(fèi)時、費(fèi)試劑、步驟較多、再加上甲基硫菌靈易降解，不適合測定苯并咪唑類殺菌劑殘留。為縮短前處理時間和減少前處理步驟，牟仁祥等［2］利用乙二胺基-N-丙基（primarysecondaryamine，PSA）凈化樣品提取液建立了快速的分散固相萃取凈化方法，凈化后的樣品提取液經(jīng)稀釋后直接進(jìn)行LC分析。由于水果中苯并咪唑類殺菌劑限量（0.1～ 10mg·kg－1）較高以及LC-MS／MS對苯并咪唑類殺菌劑分析的高靈敏性和選擇性，本研究嘗試建立樣品經(jīng)乙腈提取后直接稀釋進(jìn)行分析的LC-MS／MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

WatersAcquityUPLCXevoTMTQMS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配置電噴霧離子源；Sigma3k15型離心機(jī)（德國）；Ultra-TyrraxT25型勻質(zhì)器（德國）。苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈和甲醇均為色譜純（Fisher公司）；甲酸為色譜純（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；蘋果、草莓和葡萄均為市售。

1.2 儀器條件

AcquityBHEC18色譜柱（100mm×2.1mm，內(nèi)徑1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈。

梯度洗脫條件：B相在0.5min內(nèi)保持15%，然后在2.5min內(nèi)線性增至90%，保持1.0min；在0.1min內(nèi)降至15%，保持0.9min；流速0.3 mL·min－1，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件。ESI源正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓1.0kV，萃取錐孔電壓20V，RF透鏡電壓0.5V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，錐孔氣流速50L·h－1，脫溶劑氣流速1000L·h－1，倍增器電壓650V，二級碰撞氣為氬氣，其他條件詳見表1。

表1 苯并咪唑類殺菌劑的定性、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量

1.3 樣品處理

母乳中含有嬰兒生長發(fā)育所需的營養(yǎng)成分及抗體,是嬰兒最好的食品。同時,母乳喂養(yǎng)也能促進(jìn)子宮收縮,減少產(chǎn)后并發(fā)癥發(fā)生,加速惡露排出,不僅利于產(chǎn)婦產(chǎn)后康復(fù),也利于親子情感[1]。但是受多種因素影響,我國目前母乳喂養(yǎng)率低于世界水平,尤其是剖宮產(chǎn)術(shù)后。剖宮產(chǎn)所致手術(shù)創(chuàng)傷會導(dǎo)致產(chǎn)婦產(chǎn)生身體應(yīng)激反應(yīng),術(shù)后可能出現(xiàn)體位不適、傷口疼痛、睡眠不足等,無法做到按需哺乳。泌乳不足及乳房脹痛是導(dǎo)致無法母乳喂養(yǎng)的主要原因。針對母乳喂養(yǎng)中存在的問題,本研究將射頻電療用于剖宮產(chǎn)術(shù)后護(hù)理中,現(xiàn)報(bào)道如下。

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取10g水果樣品于帶蓋的聚四氟乙烯離心管中，加入20mL乙腈，高速勻漿1min后加5g無水硫酸鎂，劇烈振搖1min，以5000r· min－1離心3min，吸取上層有機(jī)溶劑50μL，與0.25mL乙腈和1.7mL0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22μm濾膜后進(jìn)行LC-MS／MS分析。

1.3.2 線性試驗(yàn)

分別稱取10mg苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈等5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度配置成1000μg· mL－1的儲備液。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1mL于100mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容得到10μg·mL－1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用0.1%甲酸溶液稀釋成2×10－5，2×10－4，5×10－4，0.002，0.005，0.02和0.075mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LCMS／MS分析，每濃度進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液線性試驗(yàn)

樣品經(jīng)1.3.1進(jìn)行提取后，分別吸取12.5，25，50，100和200μL上清液與20μL乙腈配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.002，0.02，0.05，0.2，0.5，2.0和7.5mg·L－1）、適量乙腈和0.1%甲酸溶液混合均勻，使除吸取200μL上清液配制的溶液外，其余2mL最終溶液中乙腈／水為85／15（V／V），混合溶液過0.22μm濾膜后進(jìn)行LC-MS／MS分析。以各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各物質(zhì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收率試驗(yàn)

本研究進(jìn)行水果樣品的添加回收率試驗(yàn)，樣品處理同1.3，樣品中5種苯并咪唑類藥物的添加濃度分別為0.01，0.05，0.5和5.0mg·kg－1。

2 結(jié)果與分析

苯并咪唑類殺菌劑色譜分析時，通常采用反相分離體系，主要有3類流動相體系：離子增強(qiáng)體系，pH值為2～3，一般使用乙腈-磷酸或磷酸鹽體系；離子抑制流動相體系，pH值為5～7；離子對流動相體系，離子增強(qiáng)流動相中加入陰離子對試劑。對多組分苯并咪唑類殺菌劑液相色譜質(zhì)譜分析時，通常采用離子增強(qiáng)體系進(jìn)行梯度洗脫，如0.1%甲酸溶液-乙腈體系，因?yàn)樵擉w系和純水-乙腈體系相比色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到明顯改善。

苯并咪唑類殺菌劑屬弱堿性物質(zhì)，在酸性條件下極易質(zhì)子化。利用Intellistart軟件對5種苯并咪唑類殺菌劑在ESI＋模式下進(jìn)行參數(shù)選擇和優(yōu)化，得到定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量。同時為提高分析靈敏度，時間窗口分為2段，分析時進(jìn)行分段掃描。由圖1可知，5種殺菌劑藥物的峰形均較好，未見有明顯的干擾峰。

2.2 前處理方法的建立

牟仁祥等［2］研究表明，蔬菜和水果樣品用乙腈提取后，采用硫酸鎂進(jìn)行鹽析，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的回收率均較好。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，在此條件下，包括硫菌靈和苯菌靈在內(nèi)的5種苯并咪唑類殺菌劑的提取回收率均超過90%。因此本研究首先采用乙腈對樣品中的苯并咪唑類殺菌劑進(jìn)行提取，再用硫酸鎂進(jìn)行鹽析，然后對鹽析后的提取液采用不同稀釋配比進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。

從圖2可知，蘋果樣品提取液中5種苯并咪唑類殺菌劑經(jīng)20倍稀釋后基質(zhì)效應(yīng)較小（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比0.9～1.1），草莓和葡萄樣品提取液經(jīng)40倍稀釋后基質(zhì)效應(yīng)較小，本研究最終樣品均采用40倍稀釋進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 5種苯并咪唑類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（a1－a2，濃度為2×10－5mg·L－1）、葡萄空白樣品（b1－b2）、添加樣品（c1－c2，添加濃度為0.01mg·kg－1）MRM色譜圖

2.3 線性試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2線性試驗(yàn)結(jié)果，對5種苯并咪唑類殺菌劑2×10－5～0.075mg·L－1濃度以峰面積對濃度作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝4.21×107X－152.61（噻菌靈），Y＝1.96×107X＋318.59（多菌靈），Y＝8.36×106X＋160.95（苯菌靈），Y＝5.56×106X＋143.44（硫菌靈）和Y＝2.13×106X＋69.61（甲基硫菌靈），相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.999，說明本方法適用于5種苯并咪唑類殺菌劑的定量分析。

2.4 方法的檢出限、回收率和精密度

按照試驗(yàn)測定步驟，在3種水果空白樣品中添加苯并咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每濃度添加3個樣品，按1.3進(jìn)行樣品處理，測定加標(biāo)回收率，考查方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

由表2可知，添加濃度0.01～5.0mg·kg－1時，5種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率78.5%～94.2%，變異系數(shù)2.7%～4.7%，能滿足殘留分析要求。其余2種水果中，5種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在75.0%～93.8%，變異系數(shù)在2.2%～4.9%。同時按定性離子對信噪比3∶1計(jì)算，該方法對5種苯并咪唑類殺菌劑的檢出限為6.0×10－4～0.003mg·kg－1；按定性離子對信噪比10∶1計(jì)算，該方法對苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈的定量限分別為0.005，0.005，0.01，0.01和0.002mg· kg－1。我國GB2763—2012規(guī)定了水果中苯菌靈、多菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈的最高殘留限量分別在3～5，0.1～5，2～3和5～10mg·kg－1，而本法的定量限僅0.002～0.01mg·kg－1，可見本法完全能滿足實(shí)際樣品測定的需要。

2.5 方法應(yīng)用

2013年利用該法對寧波市87個葡萄樣品中的5種苯并咪唑類殺菌劑進(jìn)行殘留量測定，結(jié)果表明，25個樣品中檢出多菌靈，含量在0.011～0.39mg·kg－1，3個樣品有噻菌靈殘留，濃度為0.030～0.079mg· kg－1，其余3種苯并咪唑類殺菌劑未檢出。

圖2 不同樣品提取液經(jīng)不同倍數(shù)稀釋后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值

表2 葡萄中苯并咪唑類殺菌劑在不同添加濃度的平均回收率和變異系數(shù)

3 小結(jié)

試驗(yàn)建立了快速測定水果中苯并咪唑類藥物的多殘留LC-MS／MS分析方法。對勻質(zhì)后的樣品用乙腈提取，再采用硫酸鎂鹽析，經(jīng)鹽析后的提取液直接稀釋后進(jìn)行LC-MS／MS分析。對上述5種殺菌劑，本方法回收率在75.0%～95.0%，變異系數(shù)在2.0%～5.0%，方法檢出限在6.0×10－4～0.003mg·kg－1，定量限在0.002～0.010mg· kg－1。LC-MS／MS分析方法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠滿足現(xiàn)行農(nóng)產(chǎn)品中苯并咪唑類殺菌劑的分析要求。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

TS255

B

0528-9017（2014）08-1240-04

文獻(xiàn)著錄格式：壽林飛，楊挺，徐堅(jiān)，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中5種苯并咪唑類殺菌劑［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：1240－1243.

2014-06-14

寧波市農(nóng)科教結(jié)合項(xiàng)目（2013NK33）；2014年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目

壽林飛（1979－），男，浙江諸暨人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事農(nóng)藥殘留檢測與研究工作。E-mail：lfshou＠163.com。

吳銀良（1975－），男，教授級高工，從事農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留分析研究工作。E-mail：wupaddyfield＠sina.com。