蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中抗菌肽分離純化試驗(yàn)初報(bào)

黨向利，厲曉臘，劉又高，金軼偉，陳官菊，潘益虎，柴一秋?

（1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽合肥 230036）

蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中抗菌肽分離純化試驗(yàn)初報(bào)

黨向利1，2，厲曉臘1，劉又高1，金軼偉1，陳官菊1，潘益虎1，柴一秋1?

（1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽合肥 230036）

以蟬擬青霉022007-9菌株為研究對象，對不同的發(fā)酵培養(yǎng)液對蟬擬青霉發(fā)酵液抗菌活性的影響進(jìn)行研究，篩選出較佳發(fā)酵培養(yǎng)液：0.5%蛋白胨，2%蔗糖，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，蒸餾水1L。從其代謝產(chǎn)物中，經(jīng)過濾、離心、脫糖、鹽析和各種柱層析方法，分離得到具有抗菌活性的組分G1，電泳及RP-HPLC驗(yàn)證其具有較高的純度，初步表明蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中含有一些小分子量的具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。G1組分對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌效果，具有較好的熱穩(wěn)定性，有望開發(fā)成一種天然肽類抗菌藥物和食品防腐保鮮添加劑。

蟬擬青霉；代謝產(chǎn)物；抗菌肽；發(fā)酵；純化

近年來，隨著抗生素和化學(xué)防腐劑的濫用所引發(fā)的食品安全問題頻現(xiàn)，引起了人們對新型抗菌藥物和防腐保鮮添加劑研發(fā)的思考?？咕氖巧锏钟鈦砦⑸锶肭值氖滓谰€，在生物的天然免疫中扮演重要角色［1－2］?？咕脑谏矬w內(nèi)廣泛存在，具有抗性廣泛（抗細(xì)菌、真菌、病毒等）、無細(xì)胞毒性和不誘發(fā)抗性等特點(diǎn)［3］，在抗菌殺毒和食品保鮮研究領(lǐng)域日益受到學(xué)界關(guān)注。

研究表明，真菌中具有許多結(jié)構(gòu)新穎、具有抗菌活性的物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)的主要包括萜類、皂苷、生物堿類、芳香類、甾體類、酚類、酚酸類及肽類等［4］，其中，抗菌肽是重要的一類。例如白灰制菌素（LeucinostatinA）［5］、EchinocandinA、EchinocandinB、EchinocandinD和Echinocandin H［6］、Cryptocandin［7］、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1［8］和AF2［9］等。作為一類重要的真菌資源，從蟲生真菌中分離抗菌肽的研究目前并不多，僅Krasnoff等［10］從根足蟲草Cordyceps heteropoda中分離純化出2個抗菌肽類物質(zhì)，cicadapeptinsI和cicadapeptinsII。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界蟲生真菌約100屬800多種，在我國已報(bào)道的有405種［11］。與豐富的蟲生真菌資源相比，其中顯然還存在著許多未被鑒定的抗菌肽甚至新的抗菌肽種類。蟬擬青霉（Paecilomycescicadae（Miquel）Samson）是從蟬若蟲僵尸上分離到的半知菌綱擬青霉屬的蟲生真菌。前期研究表明，蟬擬青霉022007-9菌株的發(fā)酵液對多種細(xì)菌（如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）和真菌（如白色念球菌）均有較高的抑制作用，暗示蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中可能存在一些具有較強(qiáng)抗菌活性的物質(zhì)。本文研究了不同的發(fā)酵培養(yǎng)液對蟬擬青霉發(fā)酵液抗菌活性的影響，確立了較佳的發(fā)酵培養(yǎng)液。通過純化，從蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中分離得到1個具有抗菌活性的組分G1，利用Tricine-SDSPAGE蛋白電泳及RP-HPLC對其純度進(jìn)行檢測，初步表明蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中含有一些小分子量的具有抗菌活性的抗菌肽類物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

蟲生真菌菌種為蟬擬青霉（P．cicadae（Miquel）Samson）022007-9菌株，由浙江省亞熱帶作物研究所植物保護(hù)與蟲生真菌研究室分離獲得。

供試細(xì)菌為大腸桿菌EscherichiacoliK12D31（革蘭氏陰性菌），金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（革蘭氏陽性菌），由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院汪延生博士贈送。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)液的篩選

1.2.1 培養(yǎng)基

蟲生真菌菌種活化培養(yǎng)基。PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1L）。

發(fā)酵培養(yǎng)液。①馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1L；②蛋白胨5g，蔗糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸餾水1L；③蛋白胨5g，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸餾水1L。

LB營養(yǎng)豐富液體培養(yǎng)基（m／V）。1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸出粉，1%NaCl，pH值7.0～7.2。

LB營養(yǎng)缺乏液體培養(yǎng)基（m／V）。1%胰蛋白胨，0.5%NaCl，pH值7.0～7.2。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

蟲生真菌菌種活化及種子制備。挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培養(yǎng)，（25±1）℃活化7～10d。用滅菌蒸餾水加入斜面中，將孢子沖洗下來，用力震搖3～5min，制成孢子懸浮液（種子），血球計(jì)數(shù)法計(jì)算孢子濃度待用。

發(fā)酵培養(yǎng)。將6×107孢子分別接種到250mL不同的發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床轉(zhuǎn)速120r·min－1，（25±1）℃條件下培養(yǎng)7d，重復(fù)3次。搖床結(jié)束后分別取濾液和菌絲體，測定菌絲體干重及濾液對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

1.3 供試細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌在LB營養(yǎng)豐富液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃過夜。為了增加生物活性測定實(shí)驗(yàn)的敏感性，生物活性測定用細(xì)菌在LB營養(yǎng)缺乏液體培養(yǎng)基中31℃培養(yǎng)18h。

1.4 抗菌活性測定

參照Lambert等［12］的平板打孔穴抑菌法，取缺乏營養(yǎng)的LB固體培養(yǎng)基約20mL，融化后冷卻至45℃左右，加入30μL的生測菌（D600＝0.3），搖勻后倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)基完全凝固后，在平板上打孔，孔徑6mm，每孔加入待測樣品100μL，以同體積的水作為對照（陰性），室溫下待樣品完全擴(kuò)散后，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.5 抗菌肽分離純化

1.5.1 發(fā)酵液處理

真菌發(fā)酵液經(jīng)雙層紗布（100目）過濾去除菌絲后，4℃12000r·min－1離心30min除去發(fā)酵液中較大顆粒物質(zhì)。按10∶1（V／V）加入無水乙醇，64℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50倍。按1∶3（V／V）加入無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬螅?℃冰箱內(nèi)靜置過夜沉淀多糖，后在4℃下，12000r·min－1離心30min。收集上清，64℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用滅菌蒸餾水重溶，得樣品A。檢測其對細(xì)菌的抗菌活性。

1.5.2 硫酸銨鹽析

將上述滅菌蒸餾水重溶后的樣品A在4℃條件下緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌使硫酸銨的飽和度達(dá)到60%，攪拌30min，靜置過夜，后在4℃下，12000r·min－1離心30min。分別收集上清和沉淀。沉淀溶于滅菌蒸餾水中，經(jīng)0.45μmol· L－1膜過濾后，保留濾液，得樣品B。對濾液和脫鹽后的上清進(jìn)行抗菌活性測定和Tricine-SDS-PAGE電泳檢測。

1.5.3 SephadexG-15柱層析

將樣品B（1mL）上樣于SephadexG-15柱（2.6cm×10cm），以純水作為流動相洗脫，流速4mL·min－1，檢測波長為280nm，按峰收集各組分。冷干后用滅菌蒸餾水重溶，檢測各自的抗菌活性，保留活性峰（得樣品II），低溫下凍存。

1.5.4 DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析

將SephadexG-15層析后活性峰樣品（II）1mL上樣于DEAE-SepharoseFF陰離子交換柱（2.6cm×10cm），流速3mL·min－1，檢測波長280nm。分別以0.05，0.1，0.3，0.5和1mol· L－1NaCl緩沖液（pH值6.5）進(jìn)行洗脫，收集各峰組分，冷干后用滅菌蒸餾水重溶，檢測各個峰組分的抗菌活性，保留活性峰（得樣品1），低溫凍存。Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳檢測其組成。

1.5.5 SephadexG-50柱層析

將樣品1（1mL）上樣于SephadexG-50柱（1.6cm×30cm），以0.05mol·L－1NaCL緩沖液（pH值6.5）作為流動相洗脫，流速0.4mL· min－1，檢測波長280nm，4mL·管－1收集各組分。冷干后用滅菌蒸餾水重溶，檢測各組分的抗菌活性，保留活性峰（得到樣品G1），低溫凍存。Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳檢測其組成。

1.6 純化樣品的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測

純化樣品的純度及分子量估算參考Sch?gger等［13］的Tricine-SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行，用4%濃縮膠，16.5%離膠。將樣品和樣品緩沖液按1∶1（V／V）混合，沸水浴加熱5min，5000g離心7min。上清每孔上樣15μL。30V電壓電泳至樣品完全從濃縮膠進(jìn)入分離膠時，電壓加至80V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至分離膠底部時，停止電泳。染色20～30min（染色液：50%甲醇，10%乙醇，0.2%G-250），脫色液（10%甲醇，10%冰醋酸）脫色20～30min，脫色完畢，把膠放在水中觀察拍照。

1.7 RP-HPLC（反相-高效液相色譜）檢測

將SephadexG-50柱層析后活性峰樣品（G1）經(jīng)自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，上樣體積10μL，色譜柱：SunFireTMC18（4.6mm×250mm，5μmol·L－1，Waters），系統(tǒng)：AgilentTechnologies1200series。用2%乙腈水溶液（含0.05%三氟乙酸）沖洗8min。然后用2%～60%乙腈水溶液（含0.05%三氟乙酸）梯度洗脫60min；最后用100%乙腈沖洗8min。流速：0.5mL·min－1。柱溫：室溫。220nm波段檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)液篩選

不同的發(fā)酵培養(yǎng)液對蟬擬青霉發(fā)酵液抗菌活性的影響見表1。無論是從抑菌圈直徑，還是從單位重量菌絲體產(chǎn)生的抑菌圈直徑（即抗菌效價）來評價，②號發(fā)酵培養(yǎng)液的抗菌效果要優(yōu)于①號，抗菌效價提高了39.6%。對比②號和③號發(fā)酵培養(yǎng)液（氮源固定，碳源變化）可以看出，不同的碳源既影響菌體生長，又影響抗菌效價。從抗菌效價上看，②號培養(yǎng)液的效果明顯優(yōu)于③號培養(yǎng)液，抗菌效價提高58.5%。據(jù)此，確定實(shí)驗(yàn)室條件下，蟬擬青霉022007-9菌株以②號培養(yǎng)液最適宜培養(yǎng)產(chǎn)生具有較高抗菌效價的發(fā)酵液。

表1 不同發(fā)酵培養(yǎng)液對發(fā)酵液抗菌活性的影響

2.2 抗菌肽分離純化

2.2.1 處理后發(fā)酵液的抗菌活性

處理后的發(fā)酵液對革蘭氏陰性菌（E．coli K12D31）和革蘭氏陽性菌（S．a(chǎn)ureus）均具有抗菌活性，抑菌圈直徑分別為（20.50±0.50）mm和（22.83±0.76）mm，對S．a(chǎn)ureus抗菌活性更高。

2.2.2 硫酸銨鹽析

從圖1可以看出，硫酸銨鹽析后活性組分完全保留在沉淀中，而上清脫鹽后的2個組分不具有抗菌活性。Tricine-SDS-PAGE小肽電泳檢測結(jié)果如圖2所示，沉淀中的蛋白類物質(zhì)主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子蛋白或肽類，暗示蟬擬青霉發(fā)酵液中可能有一些具有抗菌活性的蛋白或肽類。而鹽析后的上清中只含有極少量分子量較大的蛋白類物質(zhì)。

圖1 鹽析后沉淀及上清對E．coli（A）和S．a(chǎn)ureus（B）的抗菌活性

圖2 鹽析后沉淀及上清Tricine-SDS-PAGE電泳檢測

2.2.3 SephadexG-15柱層析

鹽析后活性組分（沉淀，即樣品B）經(jīng)SephadexG-15柱層析后的色譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，經(jīng)SephadexG-15柱層析后得到Ⅰ和Ⅱ2個組分。2個組分的抗菌活性結(jié)果如圖4所示，其中組分Ⅱ具有抗菌活性（圖4中4號點(diǎn)樣孔），對E．coliK12D31和S．a(chǎn)ureus的抑菌圈直徑分別為11.5mm和10.5mm，而組分I沒有抗菌活性。

2.2.4 DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析

SephadexG-15柱層析后活性峰組分Ⅱ經(jīng)DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析后的色譜結(jié)果如圖5所示。共收集得到5個峰組分，其中第1個洗脫峰（峰1，即0.05mol·L－1NaCl洗脫下來的峰）即為活性峰，對S．a(chǎn)ureus的抑菌圈直徑為18.5mm，其余各峰組分均沒有抗菌活性。

圖3 鹽析后沉淀的SephadexG-15柱層析色譜圖

圖5 SephadexG-15柱層析后活性組分Ⅱ的陰離子交換層析

2.2.5 SephadexG-50柱層析

陰離子交換層析后活性組分1進(jìn)行Sephadex G-50柱層析，色譜結(jié)果如圖6所示。在試驗(yàn)中共收集了19個組分，其中G1組分具有抗菌活性，抑菌圈直徑為19mm。

圖6 陰離子交換層析后活性組分的SephadexG-50柱層析

2.3 蟬擬青霉抗菌肽對細(xì)菌的抑制活性

如表2所示，蟬擬青霉抗菌肽對革蘭氏陰性菌（E．coliK12D31）和革蘭氏陽性菌（S．a(chǎn)ureus）均具有抗菌活性，且效果要好于常用的天然肽類防腐劑（Nisin）和化學(xué)防腐保鮮劑（脫氫醋酸鈉）。

表2 蟬擬青霉抗菌肽、Nisin和脫氫醋酸鈉對細(xì)菌的抑制作用

2.4 Tricine-SDS-PAGE電泳

SephadexG-50柱層析后活性組分（G1）的Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。與未純化的濃縮發(fā)酵液（圖7第1泳道）相比，G1組分顯示出了較高的純度，分子量主要是一些低于5.8ku的小肽（圖中箭頭所示的小肽分子量約為5.8ku），進(jìn)一步表明蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中抗菌物質(zhì)可能是小分子量的抗菌肽類。箭頭所示的5.8ku的小肽是其中的主要成分。

2.5 RP-HPLC檢測

對SephadexG-50柱層析后活性組分（G1）利用RP-HPLC進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖8。G1活性組分經(jīng)RP-HPLC層析分離后，各個色譜峰分離效果較好，含有6個主要的峰組分。

圖7 分離純化各組分的Tricine-SDS-PAGE電泳

圖8 SephadexG-50柱層析后活性組分的RP-HPLC檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本文對產(chǎn)生抗菌肽的蟲生真菌蟬擬青霉的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行了初步篩選，篩選出的較佳的發(fā)酵培養(yǎng)液為，0.5%蛋白胨，2%蔗糖，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O。從其代謝產(chǎn)物中，經(jīng)過濾、離心、脫糖、鹽析和各種柱層析，分離得到了具有抗菌活性的組分G1，電泳及RP-HPLC試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證其具有較高的純度，初步表明蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中含有一些小分子量（低于5.8ku）的具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。所分離出的抗菌肽類物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性（64℃下處理6h不喪失抗菌活性），對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性。但本研究從蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中分離出的抗菌肽是何類型，是一種還是多種，這些都有待今后深入研究。

在開始對任意來源的材料進(jìn)行分離純化之前，研究其活性的來源非常重要。微生物在生長代謝過程中分泌2種類型的代謝產(chǎn)物，初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。前者是微生物在對數(shù)生長期的產(chǎn)物，后者是穩(wěn)定期的產(chǎn)物。真菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是微生物的次級代謝產(chǎn)物［14］。培養(yǎng)條件對次級代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量影響較大。本研究只對產(chǎn)生抗菌肽的蟬擬青霉發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行了初步的篩選，對其他因素（如營養(yǎng)成分、培養(yǎng)溫度、pH條件等）并未進(jìn)行優(yōu)化，因而蟬擬青霉產(chǎn)生抗菌肽的最佳發(fā)酵條件還需通過一系列的多因素交叉試驗(yàn)來確定。

根據(jù)目前所掌握的文獻(xiàn)資料顯示，真菌來源的抗菌肽數(shù)量很少。而從蟲生真菌中分離抗菌肽的研究更為少見。蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中的抗菌肽具有較好的抗菌活性，在本研究中，其在較低的純度條件下就顯示出優(yōu)于天然肽類防腐劑Nisin和化學(xué)防腐保鮮劑脫氫醋酸鈉的抗菌效果，而且具有較高的耐熱性。當(dāng)前，在多重耐藥菌難于控制和化學(xué)防腐劑不時引起食品安全問題的背景下，傳統(tǒng)的抗菌藥物和抗生素研發(fā)周期過長，難以滿足市場需求，從蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中研發(fā)天然肽類抗菌藥物和食品防腐保鮮添加劑無疑為相關(guān)研究提供了一種新的思路。

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（責(zé)任編輯：高 峻）

Q939.9

A

0528-9017（2014）08-1232-05

文獻(xiàn)著錄格式：黨向利，厲曉臘，劉又高，等.蟬擬青霉代謝產(chǎn)物中抗菌肽分離純化試驗(yàn)初報(bào)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：1232－1237.

2014-03-18

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C22071）；浙江省自然科學(xué)基金（Y3110597；Y3100625）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（S20090017）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動項(xiàng)目

黨向利（1977－），男，山東棗莊人，博士，副研究員，主要從事抗菌肽及昆蟲免疫研究工作。E-mail：xianglidang＠aliyun.com。

柴一秋。E-mail：chai-yiqiu＠yeah.net。