秋水仙素誘導(dǎo)四倍體耐熱長豇豆的研究

李艷艷，周鴻章，張蜀寧?，呂 煒，陳俊川

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210095；2.南京理想種苗有限公司，江蘇南京 210042）

秋水仙素誘導(dǎo)四倍體耐熱長豇豆的研究

李艷艷1，周鴻章2，張蜀寧1?，呂 煒1，陳俊川2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210095；2.南京理想種苗有限公司，江蘇南京 210042）

以二倍體豇豆莢天下3號為材料，用不同濃度秋水仙素處理其子葉期莖尖生長點(diǎn)，通過對變異株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、農(nóng)藝學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定，獲得同源四倍體（2n＝4x＝44）。結(jié)果表明，0.2%秋水仙素處理4次的效果最佳，四倍體誘變率達(dá)到2.33%。與二倍體相比，四倍體植株葉片厚度和寬度、氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目、花器官大小、花粉粒大小、種子寬度等均表現(xiàn)巨大性，氣孔密度和單果莢種子數(shù)明顯降低；四倍體豇豆莢果橫莖、長度、鮮重、干物質(zhì)含量等農(nóng)藝學(xué)性狀明顯高于二倍體。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定，二倍體DNA相對含量為250，四倍體為500。根尖染色體鑒定的結(jié)果與流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果一致。

長豇豆；秋水仙素誘導(dǎo)；四倍體

豇豆（VignasesquipedalisWight.）屬于豆類蔬菜，其嫩莢營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)肥厚，炒食脆嫩，也可燙后涼拌或腌泡，是我國主要的常規(guī)蔬菜栽培品種之一，在生產(chǎn)上有較大栽培面積。我國栽培豇豆資源的遺傳多樣性很低［1］，而目前豇豆的育種工作，主要集中在從栽培種質(zhì)中篩選優(yōu)良品種，其可選范圍較狹隘，應(yīng)把豇豆育種策略轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大遺傳多樣性上來。多倍體育種可以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的新品種，已在黃瓜［2］、青花菜［3］、番茄［4］等蔬菜中得到體現(xiàn)。豇豆屬于嚴(yán)格的自花授粉植物，經(jīng)過染色體加倍，不僅擴(kuò)大了豇豆種質(zhì)資源，增加遺傳多樣性，而且還可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性?；诖?，本研究旨在創(chuàng)制四倍體豇豆新種質(zhì)，擴(kuò)大豇豆育種種質(zhì)范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

選取蘇浙地區(qū)市場上綜合性狀較好的耐熱品種莢天下3號二倍體豇豆（2n＝2x＝22）作為試材，材料由南京理想種苗有限公司提供。試驗于2013年6－12月在南京理想種苗有限公司和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)處理

2013年6月11日將催過芽的種子播種在穴盤中，6月17日70%豇豆子葉打開，用秋水仙素溶液點(diǎn)滴生長點(diǎn)，每天6：30－7：00，16：30－17：00各進(jìn)行1次（1d記為2次）。秋水仙素溶液設(shè)為0.1%，0.2%，0.3%等3水平，處理次數(shù)為2，4，6次3水平。對照組用蒸餾水處理。

1.2.2 多倍體鑒定

表型變異特征測定。依照對照組豇豆正常生長形態(tài)，挑選有明顯表型變異的植株。每株選取5～6片完全展開的功能葉片，用測量尺和游標(biāo)卡尺分別測量葉片長度、寬度、厚度，花器官大小，果莢橫莖，商品成熟期和生理成熟期果莢長度，并統(tǒng)計單個果莢種子數(shù)。

葉片下表皮氣孔特征觀察。從變異群體中挑選部分有代表性的植株。撕取葉片下表皮，平鋪于載玻片上。用1%碘-碘化鉀染色8min，然后于顯微鏡下進(jìn)行觀察，分別選取10株對照植株和變異植株。每株取2個葉片。每個葉片選取10個視野，統(tǒng)計氣孔密度和氣孔內(nèi)葉綠體數(shù)目，測量氣孔大小，并拍照保存。

花粉粒觀察。以對照株花器官作參考，在變異株中選擇花瓣大和顏色深的植株，于早上7：00采集花粉，在顯微鏡下觀察，測量大小并拍照保存。

流式細(xì)胞儀檢測。取對照植株、處理植株的新鮮葉片0.2g。用流式細(xì)胞儀測定變異植株和對照植株體細(xì)胞DNA的相對含量。具體方法參照張振超等［5］方法。

根尖染色體數(shù)觀察。將收獲的通過流式細(xì)胞儀鑒定的M0代四倍體豇豆種子和對照組獲得的二倍體豇豆種子，浸泡生根。取1～2cm根尖在0.02mg·L－1的8-羥基喹啉中預(yù)處理4h，用卡諾液固定24h，在1mol·L－1HCl60℃解離12min，用改良卡寶品紅染色制片，在ZeissAxioskop40顯微鏡觀察并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對豇豆誘導(dǎo)的影響

從表1看出，3種濃度不同處理次數(shù)的秋水仙素誘導(dǎo)均可產(chǎn)生變異，獲得四倍體植株。隨濃度升高和次數(shù)增加，變異率增加，存活率逐漸下降，四倍體變異率不成正相關(guān)，主要原因可能與秋水仙素毒害作用有關(guān)，秋水仙素影響植物的正常有絲分裂行為，分生細(xì)胞多次加倍導(dǎo)致后來的植物僵化死亡。以0.3%濃度6次處理總變異率較高，達(dá)到89.90%，存活率較低為47.12%，四倍體誘變率為0.96%，并非最佳；而0.2%濃度4次處理的四倍體變異率為2.33%，效果最佳，總變異率為77.33%，存活率為58.72%。在837株存活植株中，共得到16株四倍體。

表1 秋水仙素處理濃度和次數(shù)對豇豆誘導(dǎo)效果的影響

2.2 二倍體和四倍體豇豆比較

2.2.1 形態(tài)特征

本研究獲得的當(dāng)代四倍體豇豆生長延緩，葉片寬度增加導(dǎo)致葉尖變鈍，葉片變厚，葉色加深（圖1中A）。尤其以花器官變化最大（圖1中B），“巨大性”特征極其顯著。調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，四倍體的葉厚、翼瓣寬度、花柱粗度、果莢橫莖、干物質(zhì)含量、種子大小與兩倍體均存在極顯著差異。其中四倍體葉厚、翼瓣寬、花柱粗度、果莢鮮重分別比二倍體增加24.63%，39.53%，27.50%和29.11%；葉片寬度、龍骨瓣長度、果莢橫莖依次增加10.11%，9.16%，16.15%；四倍體10粒種子寬和20粒重分別增加10.42%和8.03%；而單個果莢種子數(shù)則減少13.21%。

圖1 二倍體、四倍體豇豆外部形態(tài)器官、氣孔、花粉粒及根尖染色體

表2 二倍體和四倍體豇豆形態(tài)特征

2.2.2 氣孔和花粉粒

四倍體葉下表皮氣孔和花粉粒的大小均比二倍體極顯著增大（表3，圖1中G，H，I，J），四倍體的氣孔以及保衛(wèi)細(xì)胞屬于整體性增大，但形態(tài)基本沒有變化。而四倍體的花粉粒不僅整體變大，形態(tài)上也變得多樣，其中以近似矩形形態(tài)出現(xiàn)的花粉粒為多數(shù)（圖1中J）。從表3看出，四倍體豇豆氣孔密度（圖1中E，F(xiàn)）減少52.88%，氣孔長、寬分別增大46.19%，39.43%，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)增加95.72%，花粉粒直徑增大24.10%。

2.2.3 細(xì)胞DNA相對含量

經(jīng)形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)篩選出27個變異株，對其進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖2所示，對照植株在熒光強(qiáng)度為250左右出現(xiàn)了1個單峰（左）。變異株中出現(xiàn)了2個結(jié)果，其中有11顆在熒光強(qiáng)度250和500附近出現(xiàn)了2個相近的峰（中），表明變異株為嵌合體（2x＋4x）；16顆在500附近出現(xiàn)了1個單峰（右），DNA含量是二倍體（2x）的2倍，表明變異株是四倍體（4x）。

2.2.4 二倍體、四倍體豇豆根尖染色體數(shù)的比較

流式細(xì)胞儀鑒定的四倍體植株根尖染色體數(shù)目為2n＝4x＝44條染色體，是二倍體的2倍（圖2中K，L），確定為四倍體。染色體鑒定結(jié)果與流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果一致。

圖2 豇豆葉片的DNA相對含量曲線

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在秋水仙素處理幼苗生長點(diǎn)20d后，變異植株葉片主要有3種類型：一類生長點(diǎn)死亡，無真葉；二類葉片小、皺縮或畸形；三類葉片顏色變深、變厚，葉尖變鈍。經(jīng)鑒定，四倍體植株主要存在于第3類中，這為以后早期篩選豇豆四倍體工作提供依據(jù)。

本研究表明以0.2%濃度4次處理的四倍體變異率為2.33%，效果最好，這與相同方法處理的不結(jié)球白菜［5］、蘿卜［6］、青花菜［3］等四倍體變異率相比較低，這不僅與品種有關(guān)，與外界環(huán)境也有一定的聯(lián)系。本研究在6月份進(jìn)行，溫度較高，秋水仙素處理幼苗條件存在一些困難：要保持水分，避免陽光直射，控制高溫防止幼苗徒長，保證點(diǎn)滴在幼苗上的藥品滲入生長點(diǎn)。另外高溫多雨天氣導(dǎo)致豇豆結(jié)實率大大降低，這要求更大的樣本量，為誘導(dǎo)工作增加一些困難。

［1］ 何禮.我國栽培豇豆的遺傳多樣性研究及其育種策略的探討［D］.成都：四川大學(xué)，2002.

［2］ 陳勁楓，雷春，錢春桃，等.黃瓜多倍體育種同源四倍體的合成和鑒定［J］.植物生理學(xué)通訊，2004，40（2）：149－152.

［3］ 張蜀寧，張麗麗，唐君，等.秋水仙素離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜［J］.園藝學(xué)報，2009，36（11）：1681－1684.

［4］ 喬永剛，宋秀英.秋水仙素誘導(dǎo)普通番茄多倍體的研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，28（2）：139－143.

［5］ 張振超，張蜀寧，張偉，等.四倍體不結(jié)球白菜的誘導(dǎo)及染色體倍性鑒定［J］.西北植物學(xué)報，2007，27（1）：28－32.

［6］ 張紅亮，張蜀寧，張偉，等.秋水仙素誘導(dǎo)同源四倍體蘿卜的研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，31（3）：47－50.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S643.4

A

0528-9017（2014）08-1174-04

文獻(xiàn)著錄格式：李艷艷，周鴻章，張蜀寧，等.秋水仙素誘導(dǎo)四倍體耐熱長豇豆的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：1174－1177.

2014-04-06

李艷艷（1988－），女，碩士生，主要從事四倍體豇豆和不結(jié)球白菜研究工作。E-mail：liyanyan134607＠163.com。

張蜀寧，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜多倍體育種。E-mail：snzhang＠njau.edu.cn。