參芪益智顆粒對(duì)5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)β淀粉樣蛋白1—42含量的影響

錢燕靜 甄軍麗 衛(wèi)東鋒 鄭焱 王曉民

摘要：目的 觀察參芪益智顆粒對(duì)阿爾茨海默病5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)和腦組織β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）含量的影響，探討其改善5XFAD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。方法 將4月齡C57BL?6野生型小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和中藥對(duì)照組，同時(shí)將同月齡5XFAD小鼠隨機(jī)分為模型組、參芪益智顆粒組和石杉?jí)A甲組，每組15只，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)60 d。給藥結(jié)束后，采用筑巢實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力；免疫組化和免疫熒光方法觀察各組小鼠皮層和海馬組織老年斑塊、Aβ1-42、小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)記物小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白1及星形膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白含量的變化。結(jié)果 與生理鹽水對(duì)照組比較，模型組小鼠筑巢實(shí)驗(yàn)得分明顯降低，避暗實(shí)驗(yàn)步入潛入期明顯縮短，水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，腦內(nèi)老年斑塊明顯增多，Aβ1-42含量明顯升高，膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯增強(qiáng)。參芪益智顆粒組小鼠上述指標(biāo)均恢復(fù)或接近至野生型小鼠水平，與模型組小鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的機(jī)制與減少腦內(nèi)老年斑數(shù)量、抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度激活、減少腦內(nèi)Aβ1-42的含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參芪益智顆粒；阿爾茨海默??；5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠；學(xué)習(xí)和記憶；β淀粉樣蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0051-06

Effects of Shenqi Yizhi Granules on Ability of Learning and Memory and Content of Aβ1-42 of Cerebral Tissue in 5XFAD Mice with Alzheimers Disease QIAN Yan-jing1，2， ZHEN Jun-li1，2， WEI Dong-feng3， ZHENG Yan1，2， WANG Xiao-min1，2 （1. Department of Neurobiology， Key Laboratory for Neurodegenerative Disorders of the Ministry of Education， College of Basic Medicine of Capital Medical University， Beijing 100069， China； 2. Beijing Institute for Brain Disorders， Beijing 100069， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To study the effects of Shenqi Yizhi Granules （SQYZ） on learning and memory and content of Aβ1-42 of cerebral tissue in 5XFAD mice with Alzheimers disease； To discuss its mechanism on improving learning and memory ability of 5XFAD mice. Methods Four-month-old C57BL?6 wild type mice were randomly divided into NS control group and SQYZ control group， and the 5XFAD mice were randomly divided into model group， SQYZ group and huperzine-A （HupA） group， 15 mice in each group. Each group were given same volume for gavage for 60 d. After treatment， the learning and memory ability were evaluated by nesting test， passive avoidance and Morris water maze test. The senile plaques and content of Aβ1-42， ionized calcium binding adapter molecule 1 and glial fibrillary acidic protein in cerebral cortex and hippocampus were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence， respectively. Results Compared with NS control group， the score of nesting test in model group significantly decreased； the step-through latency in passive avoidance was shortened and the escape latentcy in Morris water maze test was prolonged； the quantity of senile plaques and content of Aβ1-42 increased in cerebral cortex and hippocampus； the activation of glial cells significantly increased. In the SQYZ group， the above-mentioned indexes

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81571038）；北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IDHT20140514）

通訊作者：王曉民，E-mail：xmwang@ccmu.edu.cn

reached or approached the level of wild type control mice. The difference between SQYZ group and model group was statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SQYZ improved learning and memory ability in 5XFAD mice， which may be related to reduction of senile plaques， inhibition of over activation in glial cells and reduction of content of Aβ1-42 in cerebral cortex and hippocampus.

Key words： Shenqi Yizhi Granules； Alzheimer's disease； 5XFAD transgenic mice； learning and memory； Aβ1-42； glial cells

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種起病隱匿、以逐漸惡化性智能衰退為特征的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床癥狀為進(jìn)行性認(rèn)知功能損害和精神行為異常[1]。隨著老齡化社會(huì)的到來，AD發(fā)病率逐漸上升，到2030年全世界的AD患者將達(dá)6500萬，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[2]。AD患者大腦皮質(zhì)和海馬是最常受損的腦區(qū)，病理改變主要表現(xiàn)為淀粉樣老年斑（senile plaque，SP），其中以β淀粉樣蛋白（Aβ）蛋白沉積學(xué)說較為重要[3-4]。目前，臨床治療AD的藥物如鹽酸美金剛和鹽酸多奈哌齊等均為單一作用靶點(diǎn)，常伴有明顯不良反應(yīng)。AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，王永炎教授等認(rèn)為“氣虛-血瘀-痰瘀-釀毒-病絡(luò)”為AD早期的核心病機(jī)，其中氣血虧虛是AD早期發(fā)生的前提條件，痰濁血瘀是引起AD的病理因素，毒損腦絡(luò)和病絡(luò)是早期AD發(fā)生的病機(jī)核心，使髓減腦消、神機(jī)失用，日久發(fā)為呆病。因此，針對(duì)以上病機(jī)，中醫(yī)臨床防治AD以益氣健脾、活血化瘀治其本，化痰清濁、解毒通絡(luò)、醒腦開竅治其標(biāo)，使氣血充足、腦髓充盈、神機(jī)復(fù)用[5]。傳統(tǒng)中藥在改善AD患者認(rèn)知功能方面具有悠久的歷史，積累了豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，具有一定的潛在優(yōu)勢(shì)和研發(fā)價(jià)值。參芪益智顆粒是總結(jié)王永炎教授長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提煉出來的治療AD的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、人參、黃芩等中藥組成，具有益氣健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通絡(luò)之功效。本實(shí)驗(yàn)以5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型，采用筑巢實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、免疫組化及免疫熒光方法觀察參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠行為學(xué)和腦組織中SP、Aβ1-42、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白1（Iba1）及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）含量的影響，探討參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

5XFAD雜合體雙轉(zhuǎn)基因小鼠[含突變的APP基因（Swedish K670N和M671L；Florida I716V；London V717I）和早老素1基因（M146L和L286V）]源自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心使用4月齡C57BL?6野生型小鼠30只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）進(jìn)行繁殖并鑒定。4月齡轉(zhuǎn)基因小鼠50只、雌雄各半，體質(zhì)量（22±3）g，SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，分籠喂養(yǎng)，明暗交替12 h/12 h，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

參芪益智顆粒提取液由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，藥物濃度為2.24 g原藥材/mL（批號(hào)20140508），4 ℃保存?zhèn)溆?。石杉?jí)A甲（HupA，北京世紀(jì)奧科生物有限公司，批號(hào)MUST-13102808）。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠抗小鼠Aβ為6E10，Covance公司，批號(hào)SIG-39300；兔抗小鼠Iba1，Wako公司，批號(hào)019-19741；兔抗小鼠GFAP，Millipore公司，批號(hào)MAB360；免疫組化Mouse ABC試劑盒（批號(hào)PK4002）、Rabbit ABC試劑盒（批號(hào)PK4001），Vector labs公司；DAB染色試劑盒（批號(hào)ZLI-9019）、488標(biāo)記羊抗兔熒光二抗（批號(hào)ZF-0511）、594標(biāo)記羊抗兔熒光二抗（批號(hào)ZF-0516），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Aβ1-42 ELISA試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)KHB3441。Morris水迷宮系統(tǒng)和視頻分析軟件（美國(guó)Actimetrics公司），穿梭避暗實(shí)驗(yàn)箱（安徽正華生物儀器設(shè)備公司）。

1.4 分組及給藥

根據(jù)基因鑒定結(jié)果將小鼠按基因型分為野生型對(duì)照組（wild-type group，WT組）和轉(zhuǎn)基因模型組（trangenic group，Tg組）。實(shí)驗(yàn)共分5組，野生型對(duì)照組隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（WT+NS組）和中藥對(duì)照組（WT+SQYZ組），Tg組隨機(jī)分為模型組（Tg+NS組）、參芪益智顆粒組（Tg+SQYZ組）及石杉?jí)A甲組（Tg+HupA組），每組15只，雌雄各半。按藥物臨床使用劑量通過體表面積換算為小鼠給藥劑量，即參芪益智顆粒給藥劑量為5.55 g原藥材/（kg·d），石杉?jí)A甲給藥劑量為0.1 mg/（kg·d）。WT+NS組和Tg+NS組灌服等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)60 d。給藥結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)和病理觀察。

1.5 行為學(xué)檢測(cè)

1.5.1 筑巢實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的自主行為和社交能力。首先將小鼠單籠放置，適應(yīng)環(huán)境24 h 后，每籠中放入厚度為1 cm 的墊料，夜節(jié)律前2 h均勻平鋪放入剪裁大小一致的正方形無味薄紙巾片8份（每份含4張，每張邊長(zhǎng)約4.5 cm），24 h后按照文獻(xiàn)[6]改良的4分法對(duì)筑巢質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分：紙片雜亂散布在籠子各處，未被撕咬得1分；紙片被聚到籠子的一側(cè)，但較松散，無成型的巢，無明顯的撕咬或折疊得2分；紙片聚攏折疊呈成型但較平的巢，無明顯撕咬得3分；紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊得4分。

1.5.2 避暗實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)動(dòng)物的條件學(xué)習(xí)記憶功能。①記憶獲取：將動(dòng)物放在明室離門最遠(yuǎn)處，背向洞口置于明室，記錄動(dòng)物第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間（即步入潛伏期），動(dòng)物進(jìn)入暗室后對(duì)動(dòng)物足底進(jìn)行間斷的電刺激（50 Hz，36 V，1 s），5 min 后取出動(dòng)物，放回籠中。②記憶測(cè)試：于24 h 后暗室內(nèi)不給予電刺激，余條件同前，記錄小鼠5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)、第1次進(jìn)入暗室的步入潛伏期和5 min內(nèi)在明室內(nèi)的總時(shí)間[7]。

1.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。將水池隨機(jī)分為4個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)時(shí)平臺(tái)位置固定不變，置于第2象限中央，低于水面1～2 cm。實(shí)驗(yàn)前1 d為適應(yīng)及可視平臺(tái)階段，觀察其視覺及運(yùn)動(dòng)能力有無異常，對(duì)有異常的小鼠予以剔除。進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)，平臺(tái)位于水面下1 cm，除平臺(tái)所在象限外的其他3個(gè)象限為入水點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每日上下午各進(jìn)行1次。將小鼠隨機(jī)從除平臺(tái)外的3個(gè)象限輕輕地面朝壁式入水，記錄60 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），并讓其在平臺(tái)上停留30 s。若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期記為60 s。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將水中平臺(tái)去除，選擇同一象限將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在象限的時(shí)間百分比。

1.6 腦組織檢測(cè)

小鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉，剖開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室灌流37 ℃生理鹽水50 mL。打開顱骨取出腦組織，一分為二，左側(cè)半球置于4%多聚甲醛后固定24 h，經(jīng)20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，OCT固定包埋，切片（厚度30 μm），并置于切片防凍液中備用。同時(shí)，將右側(cè)半球快速分離出皮層和海馬組織，經(jīng)液氮快速冷凍后，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 腦組織老年斑檢測(cè) 0.01 mol/L PBS洗滌腦片5 min×3次，3%H2O2室溫孵育30 min，再0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；用與二抗來源一致的封閉血清室溫孵育1 h；滴加相應(yīng)比例稀釋（1∶1000）的特異性一抗6E10，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次；加入二抗工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次；DAB顯色（避光）1 min，PBS終止反應(yīng)；貼片后自然晾干，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.2 皮層和海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè) 采用Iba1、GFAP抗體分別檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。將腦片浸入0.01 mol/L PBS中洗滌5 min×3次，0.3%Trition透膜30 min，再在0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；用與二抗來源一致的封閉血清室溫孵育1 h；滴加相應(yīng)比例稀釋的特異性一抗Iba1（1∶200）和GFAP（1∶500），4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次后，加入相應(yīng)的熒光二抗工作液（避光）1 h，PBS洗滌后，貼片自然晾干，滴加封片劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 皮層和海馬組織β淀粉樣蛋白1-42含量的測(cè)定 根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)劑工作液，樣品稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液一致；將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品依次加入孔板中（樣品設(shè)復(fù)孔），每孔50 L，加入待測(cè)Aβ1-42抗體50 L，室溫孵育3 h；洗板5次，加入100 L HRP偶聯(lián)二抗，室溫30 min；洗板5次，加入100 L Stabilized Chromogen（避光），室溫30 min，加入終止液；采用酶標(biāo)儀讀板（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)570 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出待測(cè)樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為原始濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期應(yīng)用Two-Way ANOVA分析。余檢測(cè)指標(biāo)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，若方差齊采用最小顯著差法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊則采用Dunnetts T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠筑巢實(shí)驗(yàn)的影響

2.2 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

Tg+NS組較WT+NS組、WT+SQYZ組小鼠步入暗室錯(cuò)誤次數(shù)增加、步入潛伏期縮短、明室總時(shí)間減少（P<0.05，P<0.01）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)減少、步入潛伏期延長(zhǎng)、明室總時(shí)間增加（P<0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)從第4日開始，Tg+NS組小鼠逃避潛伏期較WT+NS組、WT+SQYZ組延長(zhǎng)（P<0.05）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組小鼠逃避潛伏期較Tg+NS組縮短（P<0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)，Tg+NS組小鼠游泳時(shí)間百分比較WT+NS組、WT+SQYZ組減少（P<0.01），Tg+SQYZ組和Tg+HupA組小鼠游泳時(shí)間百分比較Tg+NS組小鼠增加（P<0.05）。結(jié)果見表3。

2.4 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠皮層和海馬組織老年斑含量的影響

WT+NS組和WT+SQYZ組小鼠皮層和海馬組織均未見SP。Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織SP面積變小、數(shù)量減少（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結(jié)果見圖1、表4。

皮層

海馬

2.5 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠皮層和海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

Tg+NS組較WT+NS組、WT+SQYZ組小鼠皮層和海馬組織Iba1表達(dá)明顯升高（P<0.001）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織Iba1、GFAP表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表5。

2.6 參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠皮層和海馬組織β淀粉樣蛋白1-42含量的影響

Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織Aβ1-42含量均明顯減少（P<0.05）。結(jié)果見表6。

3 討論

目前，AD病因及確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，較為公認(rèn)的學(xué)說有Aβ級(jí)聯(lián)假說和β淀粉來源的彌散性配體（Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs）假說，但2種假說均認(rèn)為由單體Aβ1-42聚集成的寡聚體對(duì)神經(jīng)元及突觸具有明顯損傷作用，指出Aβ1-42在AD的早期病理進(jìn)程中具有重要影響。Aβ是跨膜淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細(xì)胞器經(jīng)由β、γ分泌酶的蛋白水解作用代謝而產(chǎn)生的氨基酸多肽片段，因其具1個(gè)β片層二級(jí)結(jié)構(gòu)而得名。正常情況下，腦內(nèi)以Aβ1-40為主，而AD發(fā)生時(shí)其病理產(chǎn)物SP的主要成分則以Aβ1-42為主。Aβ1-42可通過細(xì)胞外降解、細(xì)胞內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)等機(jī)制被清除，而AD患者腦內(nèi)上述Aβ清除機(jī)制明顯出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)過量聚集，形成寡聚體，黏附于神經(jīng)元，特異性地作用于突觸，干擾神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞而導(dǎo)致明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降。因此，Aβ蛋白是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，寡聚化后形成SP，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元及突觸丟失，最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)所使用5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠可共表達(dá)突變的人β-APP K670N和M671L、Florida突變I716V基因、London突變V717I以及突變?cè)缋纤氐鞍?（Presinilinl，PS1）M146L和L286V突變5個(gè)突變位點(diǎn)的基因，可較好地模擬AD患者的臨床病理特征，能夠在短期內(nèi)產(chǎn)生大量Aβ1-42及ADDLs，4月齡時(shí)已經(jīng)在大腦皮質(zhì)、海馬等區(qū)域形成大量淀粉樣斑塊，這些改變隨年齡的增加逐漸加重，并表現(xiàn)出明顯的行為學(xué)異常[7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示，4月齡5XFAD小鼠開始出現(xiàn)空間認(rèn)知功能障礙[8]，因此我們選取該月齡小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究。

20世紀(jì)80年代，王永炎教授提出“毒邪”和“絡(luò)病”可作為中風(fēng)、癡呆等疾病深入研究的切入點(diǎn)，認(rèn)為“毒損腦絡(luò)”是癡呆發(fā)生發(fā)展的核心病機(jī)，并指出益氣活血、解毒通絡(luò)是治療癡呆的關(guān)鍵。參芪益智顆粒方中黃芪健脾益氣、升陽(yáng)舉陷、托毒排膿，人參大補(bǔ)元?dú)狻采褚嬷?、補(bǔ)脾益肺、生津，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血，諸藥配伍，共奏健脾益氣、安神益智、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，參芪益智顆粒中有效活性成分黃芪總皂苷、黃芪多糖、人參皂苷、人參多糖、黃芩苷及黃芩素等均對(duì)AD動(dòng)物模型具有認(rèn)知功能改善作用，其機(jī)制與抑制腦內(nèi)Aβ1-42產(chǎn)生、提高腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量、保護(hù)線粒體能量代謝功能及增強(qiáng)腦組織抗氧化能力等密切相關(guān)[9-14]。

本研究通過多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果表明參芪益智顆粒能夠明顯改善5XFAD小鼠的社交行為和空間學(xué)習(xí)記憶能力。為進(jìn)一步研究參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制，分別采用免疫組化和免疫熒光方法對(duì)各組小鼠皮層和海馬組織SP、Aβ1-42含量、小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞激活情況進(jìn)行了定性和定量觀察，免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織SP面積及數(shù)量較野生型小鼠明顯增加，而參芪益智顆粒干預(yù)后小鼠腦組織SP面積明顯縮小，數(shù)量亦明顯減少；參芪益智顆粒組小鼠皮層及海馬組織可溶性及不可溶Aβ1-42含量均明顯降低。研究表明，AD亦是一個(gè)局灶性的、非免疫介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)過程，在腦內(nèi)可見到大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子等?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞主要分布于Aβ沉積部位，并導(dǎo)致一系列神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，模型組小鼠腦組織中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞較野生型小鼠明顯增多，而參芪益智顆粒組2種膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯降低，提示參芪益智顆粒可能通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活，降低腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究采用5XFAD轉(zhuǎn)基因擬癡呆小鼠模型評(píng)價(jià)了參芪益智顆粒的腦保護(hù)作用，結(jié)果表明參芪益智顆粒能夠明顯改善5XFAD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和社交行為，其作用機(jī)制與其能夠減少5XFAD小鼠皮層和海馬組織SP的面積及數(shù)量、降低小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、減少腦內(nèi)可溶性及不可溶Aβ1-42的含量相關(guān)。當(dāng)然，參芪益智顆粒對(duì)5XFAD小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量、抗氧化能力、改善腦內(nèi)線粒體能量代謝等方面的影響仍需進(jìn)一步深入探討，以闡明其認(rèn)知功能改善作用的分子機(jī)制，以期為參芪益智顆粒的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ANTONSDOTTIR I M， SMITH J， KELTZ M， et al. Advancements in the treatment of agitation in Alzheimer's disease[J]. Expert Opin Pharmacother，2015，16（11）：1649-1656.

[2] CLAEYSEN S， COCHET M， DONNEGER R， et al. Alzheimer culprits：cellular crossroads and interplay[J]. Cell Signal，2012，24（9）：1831-1840.

[3] GUAQUIERE-BERNARD O， ROUAUD O， MANCKOUNDIA P. Alzheimer's disease associated with sporadic cerebral amyloid angiopathy in an elderly patient[J]. Geriatr Gerontol Int，2015，15（6）：811-812.

[4] KLUNK W E. Amyloid imaging as a biomarker for cerebral beta-amyloidosis and risk prediction for Alzheimer dementia[J]. Neurobiol Aging，2011，32（Suppl 1）：s20-36.

[5] 張占軍，王永炎.腎虛-痰瘀-釀毒-病絡(luò)——中醫(yī)對(duì)老年性癡呆早期發(fā)病病機(jī)認(rèn)識(shí)[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（3）：244-246.

[6] WESSON D W， WILSON D A. Age and gene overexpression interact to abolish nesting behavior in Tg2576 amyloid precursor protein （APP） mice[J]. Behav Brain Res，2011，216（1）：408-413.

[7] JAWHAR S， TRAWICKA A， JENNECKENS C， et al. Motor deficits， neuron loss， and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease[J]. Neurobiol Aging，2012，33（1）：e29-40.

[8] WANG Q， XIAO B， CUI S Q， et al. Triptolide treatment reduces Alzheimers disease （AD）-like pathology through inhibition of BACE1 in a transgenic mouse model of AD[J]. Disease Models & Mechanisms，2014，7（12）：1385-1395.

[9] LI N， LIU B， DLUZEN D E， et al. Protective effect of ginsenoside Rg2 against jmtglutamate-induced neurotoxicity in PCl2 cells[J]. J Ethnopharmacol，2007，111（3）：458-463.

[10] 王曉英，陳霽，張均田.人參皂苷Rgl對(duì)β-淀粉樣肽（25-35）側(cè)腦室注射所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，200l， 32（1）：2-5.

[11] LI J Q， DUAN Z K， ZHANG J T. Effect of age and ginsenoside Rg1 on nitric oxide content and nitric oxide synthase activity of cerebral contex in rats[J]. Acta Pharm Sin，1992，36（4）：251-254.

[12] LU J H， ARDAH M T， DURAIRAJAN S S， et al. Baicalein inhibits formation of α-synuclein oligomers within living cells and prevents Aβ peptide fibrillation and oligomerisation[J]. Chembiochem， 2011，12（4）：615-624.

[13] 高中洪，黃開勛，卞曙光，等.黃芩黃酮對(duì)自由基引起的大鼠腦線粒體損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2000，16（1）：81-83.

[14] 鐘佩茹，王秀云，柴麗娟，等.黃芪甲苷對(duì)體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（5）：42-44.