人羊水祖細(xì)胞的分離和基因修飾

楊辰敏玥，范書，唐匯祥,，鞏芷娟，龔秀麗，任兆瑞，曾凡一,

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200023 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 發(fā)育生物學(xué)研究室，上海 200025 3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海 200040 4衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及上海市胚胎與生殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040

血友病B是由凝血因子IX (FIX) 缺乏所引起的 X連鎖隱性遺傳性出血病。全球血友病 B發(fā)病率約為每 3萬分之一男性人口[1-4]。多數(shù)患者自幼即有自發(fā)出血、外傷或手術(shù)后出血不易停止的傾向，需要經(jīng)常輸注血漿制品或者重組FIX濃縮物，然而這些治療方法非常昂貴而且會帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥。一直以來，血友病被認(rèn)為是一種適合基因治療的遺傳病，但多數(shù)針對出生后的個體的基因治療，效果不佳，大多在短期內(nèi)FIX的表達(dá)就下降了。

近年來的研究表明，干細(xì)胞宮內(nèi)移植 (In Utero Stem Cell Transplantation, IUSCT)[5-8]是克服移植免疫排斥反應(yīng)的一種有效途徑。在懷孕早期或早中期，胎兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，通過宮內(nèi)注射的方法將攜帶正常的FIXcDNA干細(xì)胞輸入到胎兒體內(nèi)，使干細(xì)胞能在受體體內(nèi)歸巢并增殖分化，從而達(dá)到治療疾病的目的。由于胚胎干細(xì)胞在宮內(nèi)移植的應(yīng)用中存在倫理問題，因此探尋合適的供體細(xì)胞對于宮內(nèi)移植和產(chǎn)前治療具有重要的價值。近年來人們在進(jìn)行產(chǎn)前診斷的羊水中發(fā)現(xiàn)了具有多能性的胎兒細(xì)胞[9-11]。為了使以羊水細(xì)胞為供體細(xì)胞的宮內(nèi)移植具有臨床應(yīng)用的可行性，首先需要建立從孕中期羊水中分離出人羊水祖細(xì)胞 (Amniotic fluid derived progenitor cell, AFPC) 的有效方法，并在體外觀察羊水祖細(xì)胞經(jīng)FIX基因修飾后的效果，為產(chǎn)前治療的實(shí)施奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用Invitrogen 公司的羊水細(xì)胞完全培養(yǎng)基(AmniomaxⅡcomplete)，通過機(jī)械刮下成克隆生長的梭形細(xì)胞傳代后，得到了形態(tài)均一的成纖維樣祖細(xì)胞，并對該細(xì)胞的特性進(jìn)行鑒定，從而建立了一套有效的羊水祖細(xì)胞分離和培養(yǎng)體系；并通過慢病毒載體將hFIXcDNA整合到hAFPCs，分析了基因修飾后的羊水祖細(xì)胞能否在體外長期、穩(wěn)定地表達(dá)有活性的hFIX。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

20例孕中期 (孕 16?22周) 羊水標(biāo)本來自在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院進(jìn)行血友病產(chǎn)前診斷檢查剩余的廢棄羊水標(biāo)本。所有羊水標(biāo)本的使用經(jīng)孕婦知情同意，并經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 主要試劑

羊水細(xì)胞完全培養(yǎng)基Ⅱ和 TRIZOL 是美國Invitrogen公司的產(chǎn)品；75 cm2培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司；RT-PCR試劑盒購于羅氏公司；PCR引物自行設(shè)計由Invitrogen公司合成，序列見表1。免疫熒光抗體見表2。phFIX質(zhì)粒由上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所曾溢滔教授惠贈。

1.3 方法

1.3.1 羊水細(xì)胞分離和培養(yǎng)

將無血液污染的孕中期羊水標(biāo)本 (10 mL)400×g離心 10 min, 棄上清，加入完全培養(yǎng)基AmniomaxⅡcomplete 2 mL，將細(xì)胞懸浮后接種至6孔板中，培養(yǎng)皿經(jīng)0.2% 明膠包被，隨后置于95%濕度，5%CO2，通過培養(yǎng)基本身對貼壁細(xì)胞的自然選擇來對羊水細(xì)胞進(jìn)行分離選擇培養(yǎng)。37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后，首次換微鏡下觀察，畫出呈致密克隆生長的梭形細(xì)胞集落的范圍，用無菌細(xì)胞刮鏟輕刮標(biāo)定范圍，刮下細(xì)胞用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/mL，接種至24孔培養(yǎng)板中，記為第1代 (P1)。以后每隔2–3 d用換液1次，當(dāng)細(xì)胞長到60%?70%融合時進(jìn)行1∶3的消化傳代。

表2 免疫熒光及免疫組化抗體Table 2 Antibodies for immunohisterochemistry

1.3.2 細(xì)胞生長曲線繪制

取80%融合的P3、P5和P10 hAFPCs，消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5 mL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液。從第2天起每隔24 h隨機(jī)取3孔細(xì)胞計數(shù)取其平均值作為當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)，繪制9 d的細(xì)胞生長曲線，接種24 h后計算細(xì)胞倍增時間，公式為TD =t× log2/log (Nt/No)(Nt為t時間的細(xì)胞數(shù)，No為初種細(xì)胞數(shù))。

1.3.3 熒光免疫染色

細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛進(jìn)行固定30 min后用加入封閉液阻斷細(xì)胞30min，隨后在4 ℃下加入一抗孵育過夜，稀釋比如下，TRA-1-60 (1∶100)，SSEA4 (1∶100)，用無抗體的PBS孵育作為陰性對照．次日用PBS將未結(jié)合的抗體洗脫，加入二抗后在37 ℃孵育l h (二抗稀釋比例=l∶100)，用DAPI進(jìn)行核染10 min；防淬滅液封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 RNA抽提

根據(jù) Invitrogen 公司的 TRIZOL操作說明書進(jìn)行。1 mL TRIZOL加入 106細(xì)胞中，抽提完成后，50 μL 的水溶解RNA樣品，測OD值定量RNA濃度。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄

按ROCHE RT kit操作步驟，取2 μg的RNA作為逆轉(zhuǎn)錄摸板在 40 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄cDNA (Complementary DNA)。

1.3.6 載體構(gòu)建

利用Gateway Technolgy系統(tǒng)構(gòu)建質(zhì)粒(圖1)。

1.3.7 慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染

采用第 3代慢病毒系統(tǒng)[12]，pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，根據(jù) Lipofectamine 2000的操作步驟轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h收獲含病毒的上清，以 0.45 μm 濾器過濾即加入已貼壁的AFPCs，同時加入聚凝胺至6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

1.3.8 流式細(xì)胞儀篩選GFP陽性細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)90%密度后，用0.25%的胰酶消化。PBS洗滌細(xì)胞2次，再用PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞 濃 度 5×106?8×106/mL。以 未轉(zhuǎn) 染 的hAFPC為陰性對照。

1.3.9 ELISA 檢測培養(yǎng)液中hFIX濃度

圖1 含有hFIX和GFPcDNAd的質(zhì)粒Fig. 1 Plasmid with FIX and GFPcDNA.

檢測樣品時均設(shè)二復(fù)孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。以10個健康個體的混合血漿作為標(biāo)準(zhǔn)物稀釋后設(shè)定橫坐標(biāo) (對數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo) (對數(shù)坐標(biāo))，得到雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的OD值代入方程式，所得hFIX濃度以正常人的血漿濃度的百分比來表示。

1.3.10 凝集測定實(shí)驗(yàn) (Clotting assay) 測定培養(yǎng)上清hFIX活性

通過使用人因子 IX缺乏的血漿來做凝血分析，采用BECKMAN公司的ACL TOP全自動凝血分析儀測定FIX活性。10個健康人的混合血漿的血液凝固參數(shù)作為對照標(biāo)準(zhǔn)，其活性為100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示，各組均值比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊水祖細(xì)胞 (hAFPCs) 的分離和培養(yǎng)

圖2 原代羊水祖細(xì)胞形態(tài)(第3天)Fig. 2 Morphology of amniocyte at the 3rd day (×100).

圖3 經(jīng)挑選和傳代后的羊水祖細(xì)胞形態(tài)Fig. 3 Morphology of human amniotic fluid derived progenitor cellse after selection and passage (×100). (A)hAFPCs P0. (B) hAFPCs P1. (C) hAFPCs P3. (D) hAFPCs P12.

孕中期羊水細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，原代羊水細(xì)胞包括兩種細(xì)胞群：貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，而hAFPCs屬于貼壁細(xì)胞群。培養(yǎng)3 d后，在倒置相差顯微鏡下觀察，可見呈克隆樣生長的梭形貼壁羊水細(xì)胞，細(xì)胞間排列緊密，核大，核仁分裂象可見。6 d后，呈克隆樣生長的梭形細(xì)胞為主的hAFPCs集落形成 (圖2) (在20例標(biāo)本皆培養(yǎng)成功)。原代羊水祖細(xì)胞排列有一定的方向性，呈旋渦狀、網(wǎng)狀及輻射狀排列生長 (圖3A)。集落生長的羊水祖細(xì)胞原代生長到第8天時，輕輕用無菌刮板刮下后傳代至 24孔板，記為 P1，傳代細(xì)胞在 12 h內(nèi)完全貼壁，約 7 d后細(xì)胞融合80%，再次傳代 (P2)。傳代后生長迅速，按照l∶3的比例進(jìn)行傳代時，需3?4 d傳代一次。刮下的hAFPCs接種培養(yǎng)后，細(xì)胞呈均勻分布生長，形態(tài)呈梭形。大約7 d達(dá)到80%融合 (圖3B)，傳到第3代時hAFPCs克隆呈現(xiàn)出均一的成纖維樣細(xì)胞 (圖3C)。傳至第12代，細(xì)胞仍呈現(xiàn)均一的成纖維樣，生長速度略有下降 (圖3D)。

羊水祖細(xì)胞生長曲線 (圖4) 具有以下共同特征：接種后第 1?2天為潛伏適應(yīng)期，從第 3天起進(jìn)入指數(shù)生長期，第 7天達(dá)到高峰，以后進(jìn)入平臺期。P3代hAFPCs的群體倍增時間為39.05 h，P5代為41.04 h，P10代為43.18 h，羊水來源的祖細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加增殖能力略有下降。

2.2 羊水祖細(xì)胞中 NANOG、OCT4、SOX2 mRNA 的表達(dá)

圖4 細(xì)胞生長曲線Fig. 4 Cell growing curve.

用定量 RT-PCR的方法檢測了機(jī)械分離出的 3株 AFPC (1?3) 表達(dá)干細(xì)胞特征基因的情況，選取管家基因β-actin為內(nèi)參照，293T細(xì)胞為陰性對照，ESCs為陽性對照。發(fā)現(xiàn)NANOG，OCT4，SOX2mRNA在羊水祖細(xì)胞 (AFPC) 中都有表達(dá) (圖 5)，與胚胎干細(xì)胞相比，分離出的AFPC表達(dá)較高水平的NANOG，SOX2mRNA，均高于ES細(xì)胞，其中NANOG的表達(dá)較高，達(dá)2.9倍 (P<0.05)。OCT4 mRNA的表達(dá)比ES細(xì)胞低，僅有0.15倍的痕跡量 (P<0.05)。

圖 5 實(shí)時熒光定量 PCR檢測 NANOG、OCT4、SOX2 mRNA在3株hAFPCs中的表達(dá)Fig. 5 Q-PCR to detect the expression of NANOG,OCT4, SOX2 mRNA in three lines of hAFPCs.

2.3 免疫熒光法檢測胚胎干細(xì)胞特異性蛋白在羊水祖細(xì)胞中的表達(dá)

為進(jìn)一步鑒定分離出的hAFPC的特性，我們用免疫化學(xué)熒光法來檢測一系列在胚胎干細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白 SSEA4，TRA1-60，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞可見SSEA4，TRA1-60在細(xì)胞表面呈陽性 (圖6)。

2.4 羊水祖細(xì)胞體外成脂肪和成骨誘導(dǎo)分化

圖6 hAFPCs免疫熒光染色Fig. 6 Immunofluorescence stain for the expression of SSEA and TRA-1-60 of hAFPCs, hESCs were used as positive control (×400).

倒置相差顯微鏡觀察可見，經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖速度下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長梭形變?yōu)槎噙呅?，誘導(dǎo)7 d后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)圓形脂滴，以后脂滴逐漸增多增大，誘導(dǎo)21 d，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)充滿了脂滴，經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂滴 (圖7A、B)。

經(jīng)成骨誘導(dǎo)5?7 d，細(xì)胞呈片狀重疊生長，細(xì)胞形態(tài)變得扁平，經(jīng)堿性磷酸酶染色 (AP染色) 提示細(xì)胞內(nèi)有大量酶顆粒形成，與成骨細(xì)胞活性相關(guān)的堿性磷酸酶表達(dá)陽性 (圖7C?D)。

2.5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的AFPC

人羊水祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染PLV-hFIX-GFP質(zhì)粒72 h后，可見較弱的綠色熒光，96 d后熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)沒有變化仍維持成纖維樣 (圖8D)，用胰酶消化后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)

圖7 羊水祖細(xì)胞成脂肪和成骨分化 (×200) Fig. 7 Adipogenesis and osteogenesis of hAPFCs. (A)3 weeks after osteogenesis, hAPFCs became multiside with much lipid drops in cytoplasma. (B) Oil red O stain showed red colour. (C) 3 weeks after osteogenesis,hAPFCs became flat. (D) AKP stain showed a lot of enzyme drops in blue colour.

陽性細(xì)胞為54.91% (圖8A)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50%以上。通過流逝篩選出GFP陽性的細(xì)胞，經(jīng)含雙倍抗生素的培養(yǎng)液懸浮后移入 6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。篩選出的細(xì)胞經(jīng) 2代擴(kuò)增后，再次進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測有綠色熒光的細(xì)胞比例，綠色熒光陽性的細(xì)胞占 95%以上 (圖 8C)，并且在24 h內(nèi)貼壁，48 h后進(jìn)入快速增長期。

2.6 轉(zhuǎn)染后 AFPC 表達(dá) hFIX 抗原濃度(hFIX：Ag) 和hFIX活性 (hFIX：C)

為了檢測轉(zhuǎn)染后的羊水祖細(xì)胞能否合成 FIX并向外分泌，我們以每孔 1×105的 AFPC重新種植在24孔板繼續(xù)培養(yǎng)8 d，分別在每2 d換液時留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液約100 μL，-20 ℃冰箱保存，直到進(jìn)行檢測 FIX：C 和 FIX：Ag。轉(zhuǎn)染后 2 d，AFPC已合成 hFIX蛋白，在上清液中的濃度為20.77%±2.77% (圖9)，凝血活性16.42%±1.78%。FIX的合成在傳代后的第 4天達(dá)到平臺期，為50.35%±5.42%，此后第6天和第8天FIX濃度分別為51.10%±6.53%，54.23%±4.98%。轉(zhuǎn)染后的羊水細(xì)胞表達(dá)的 hFIX蛋白的水平呈現(xiàn)基本穩(wěn)定趨勢，波動幅度較小。我們還發(fā)現(xiàn)上清液中的 FIX在凝血實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出凝血活性，并隨著濃度的升高而相應(yīng)增高，最高可達(dá)47.54%±3.24% (相對于正常人血清中FIX的活性)。

3 討論

羊水中有來自胎兒皮膚、消化道、呼吸道和泌尿道等組織的脫落細(xì)胞，也有來自羊膜及早期胚胎組織的脫落細(xì)胞。其中具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞比例尚無統(tǒng)一的研究結(jié)論。Prusa等[11]報道羊水中表達(dá)OCT4的細(xì)胞約為0.1%?0.5%，De Coppi等[9]分選的CD117陽性細(xì)胞占原代細(xì)胞的 1%。這些數(shù)據(jù)提示羊水中干細(xì)胞數(shù)目有限，如何對其進(jìn)行有效的分離和擴(kuò)增培養(yǎng)尤為重要。羊水細(xì)胞來源及成分復(fù)雜，不同來源的細(xì)胞貼壁、生長能力不同，因此培養(yǎng)條件在羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)中起重要作用。本研究使用富含包括bFGF等各類生長因子的Amniomax completeⅡ，有利于羊水祖細(xì)胞貼壁生長，并通過機(jī)械刮下呈克隆生長的梭形細(xì)胞，成功地分離得到形態(tài)均一的羊水祖細(xì)胞，并對其生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了研究。

圖8 流逝細(xì)胞儀篩選GFP+細(xì)胞Fig. 8 GFP+ cells were selected by flowcytometry. (A) The plasmid with FIX and GFP cDNA. (B) Untransfected hAFPCs were used as negative control. (C) 51.3% of hAFPCs expressed GFP after transfection. (D) 95.04% of hAFPCs expressed GPF after sorting. (E) AFPCs after transfected with green fluorescence.

圖 9 轉(zhuǎn)染后人羊水祖細(xì)胞的培養(yǎng)液中表達(dá)的FIX：Ag和凝血活性FIX：CFig. 9 FIX：C and FIX：Ag expressed after transfection. The expression and activity of hFIX were detected in culture medium at day 2, 4, 6, 8 after passage of transfected hAFPC. X-ray was days after passage. Y-ray was the percentage of expression and activity of hFIX in normal human blood.

本實(shí)驗(yàn)分離得到的羊水祖細(xì)胞來源于常規(guī)孕中期產(chǎn)前診斷時剩余的羊水標(biāo)本，與ESCs相比，不會破壞胚胎組織，因此避免了 ESCs的倫理問題；與BM-hMSCs相比，AFPC標(biāo)本獲取是在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺得到的，創(chuàng)傷較小，而且AFPC在較長時間內(nèi)維持自我更新和復(fù)制的能力，P10代的生長速度較 P3代僅略有下降，與Miranda-Sayago等[13]報道的相一致。同時我們得到的AFPC還能保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性：第3代和第10代AFPC形態(tài)上沒有明顯的區(qū)別。Baxter等報道[14]，與骨髓和臍血的hMSCs (第4代) 中的端粒酶長度相比，第6代人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶長度明顯長。這一發(fā)現(xiàn)也表明了羊水來源的干/祖細(xì)胞比成體的 hMSCs有較高的增殖能力，可能是由于AFDC是來源于胚胎早期，更接近ESCs。

研究表明人類ES細(xì)胞中至少有353個靶基因是OCT4、SOX2和NANOG三者共同擁有的，且 3個轉(zhuǎn)錄因子在這些基因啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)都相互接近[15]。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) AFPC能夠在mRNA分子水平同時表達(dá)這3個與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的分子。與胚胎干細(xì)胞相比，OCT-4的表達(dá)量較低，但有趣的是我們分離得到的羊水祖細(xì)胞表達(dá)的NANOG mRNA和SOX2mRNA的水平比ESCs還高。大量研究表明，OCT4[16]、NANOG[17-19]這兩個同源異型域基因是體內(nèi)外維持干細(xì)胞自我更新和保持未分化狀態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。OCT4的表達(dá)水平需維持在一定的水平，如果 OCT4過表達(dá)，將使胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞分化[20]，而 NANOG的高表達(dá)可使人類胚胎干細(xì)胞不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞就可維持干性[21]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá) SOX2的胎兒組織將發(fā)育為含有表達(dá) SOX2的成體干細(xì)胞的組織[22]，在胃、食管道、睪丸、子宮頸、肛門和眼睛晶狀體等組織特異性成體細(xì)胞群體中表達(dá)，并能夠更新它們的群體，必要時在特定組織中產(chǎn)生完全分化的細(xì)胞。這些現(xiàn)象表明SOX2似乎是一種在所有發(fā)育階段：胚胎、胎兒和成體干細(xì)胞中表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)中分離得到的AFPC在mRNA水平同時表達(dá)OCT4、NANOG、SOX2這3個關(guān)鍵基因，其中NANOG和 SOX2的表達(dá)水平較高，因此羊水祖細(xì)胞可能是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的一種細(xì)胞。

Supported by：National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 81125003), China Basic Research Program (No.2014CB964700), Shu Guang Project of Shanghai Education Commission (No. 10GG10), Shanghai Leading Academic Discipline Project (No.S30201), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality Project (No. 12XD1406500).

Corresponding author：Fanyi Zeng. Tel： +86-21-63846590; Fax： +86-21-64673297; E-mail： fzeng@sjtu.edu.cn

國家杰出青年科學(xué)基金 (No. 81125003)，科技部國家重大研究計劃 (No. 2014CB964700)，上海市教委曙光跟蹤項(xiàng)目(No. 10GG10)，上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No. S30201)，上海市科委項(xiàng)目(No. 12XD1406500)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間： 2013-12-06 網(wǎng)絡(luò)出版地址： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131206.0846.001.html

為了觀察羊水祖細(xì)胞能否應(yīng)用于血友病 B的基因治療，我們通過慢病毒載體同時轉(zhuǎn)入目的基因 FIX-cDNA和報告基因 GFP。本文使用的 hFIX cDNA來自肝臟表達(dá)文庫，同時克隆hFIX基因內(nèi)含子的部分序列，置于hFIX之前，具有高效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)[23]。hFIX作為人體血漿中重要的凝血因子，正常情況下由肝細(xì)胞合成。最初在肝臟中生成的hFIX是一種酶原，經(jīng)過在第 157位和 167位門冬氨酸部位的糖基化。N端 12個谷氨酸的羧基化，以及在肽鏈中Arg45-Ala和Ar180-vaJ處精氨酰氨鍵的斷裂，剪除146?180位共35個氨基酸的肽鏈，生成一條由 145個氨基酸構(gòu)成的輕鏈和另一條由 236個氨基酸構(gòu)成的重鏈，并通過二硫鍵連接起來，最終形成具有絲氨酸蛋白酶活性的活化hFlX[24]。

慢病毒載體可以把人凝血因子 IX (hFIX)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到羊水祖細(xì)胞，并且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FIX能夠在羊水祖細(xì)胞內(nèi)合成并分泌到上清液中，而該蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)基本穩(wěn)定趨勢，波動幅度較小，上清液中的濃度在第 4天能達(dá)到平臺期。檢測到的 FIX凝血活性也與其蛋白濃度呈正相關(guān)因此，在體外的培養(yǎng)系統(tǒng)中，羊水祖細(xì)胞不僅能夠合成hFIX，而且能正確剪切及修飾該蛋白，使其具有正常的凝血功能。

轉(zhuǎn)染了hFIX的羊水祖細(xì)胞在體外能持續(xù)合成有凝血功能的hFIX蛋白，同時保持原有的形態(tài)和增殖速度，為基因治療提供了一種新型載體，羊水祖細(xì)胞可能成為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞以外更好的、合適的細(xì)胞來源之一。為血友病B產(chǎn)前治療的新方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

[1]Roth DA, Tawa NE Jr, O'Brien JM. Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. AN Engl J Med, 2001, 344(23)： 1735–1742.

[2]Fakharzadeh SS, Zhang Y, Sarkar R, et al.Correction of the coagulation defect in hemophilia A mice through factor VIII exprssion in skin.Blood, 2000, 95(9)： 2799–2805.

[3]Lozier J. Gene therapy of the hemophilias. Semin Hematol, 2004, 41(4)： 287–296.

[4]Ponder KP. Gene therapy for hemophilia. Curr Opin Hematol, 2006, 13(5)： 301–307.

[5]Zanjani ED, Pallavicini MG, Ascensao JL, et al.Engraftment and long-term expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest, 1992, 89(4)：1178–1188.

[6]Harrison MR, Slotnick RN, Crombleholme TM, et al. In-utero transplantation of fetal liver haemopoietic stem cell in monkeys. Lancet, 1989,2(8677)： 1425–1427.

[7]Pixley JS, Tavassolio M, Zanjani ED, et al.Transplantation in utero of fetal human hematopoietic stem cells into mice results in hematopoietic chimerism. Pathobiology, 1994,62(5/6)： 238–244.

[8]Fujiki Y, Fukaua K, Kameyama K. Successful multilineage engraftment of human cord blood cells in piges fater in utero transplantation.Transplantation, 2003, 75(7)： 916–922.

[9]De Coppi P, Bartsch G Jr, Siddiqui MM, et al.Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol, 2007, 25(1)： 100–106.

[10]In 't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.Stem Cells, 2004, 22(7)： 1338–1345.

[11]Prusa AR, Marton E, Rosner M, et al.Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid： a new source for stem cell research? Hum Reprod,2003, 18(7)： 1489–1493.

[12]Li M, Husic N, Lin Y, Snider BJ. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp, 2012(63)：e4031.

[13]Miranda-Sayago JM, Fernandez-Arcas N, Benito C,et al. Lifespan of human amniotic fluid-derived multipotent mesenchymal stromal cells.Cytotherapy, 2011, 13(5)： 572–581.

[14]Baxter MA, Wynn RF, Jowitt SN, et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells followingin vitroexpansion.Stem Cells, 2004, 22(5)： 675–682.

[15]Boyer LA, Lee TI, Cole MF, et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell, 2005, 122(6)： 947–956.

[16]Pan GJ, Chang ZY, Scholer HR, et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res, 2002, 12(5/6)： 321–329.

[17]Loh YH, Wu Q, Chew JL, et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet, 2006,38(4)： 431–440.

[18]Pan G, Li J, Zhou Y, et al. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal. FASEB J, 2006,20(10)： 1730–1732.

[19]Pan G, Thomson JA. Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Res, 2007, 17(1)： 42–49.

[20]Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation,dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet, 2000, 24(4)： 372–376.

[21]Darr H, Mayshar Y, Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features.Development, 2006, 133(6)： 1193–1201.

[22]Arnold K, Sarkar A, Yram MA, et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell,2011, 9(4)： 317–329.

[23]Huang Z, Yan JB, Huang Y, et al. High expression of human FIX (hFIX) in transgenic mice directed by goat beta-casein gene promoter. J Genet Genomics, 2002, 29(3)： 206–211 (in Chinese).

黃贊, 顏景斌, 黃纓, 等. 山羊 B-酪蛋白基因啟動子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁高效表達(dá)人凝血因子. Ⅸ遺傳學(xué)報, 2002, 29(3)： 206–211.

[24]Kim HS, Kim JC, Lee YK, et al. Hepatic control elements promote long-term expression of human coagulation factor IX gene in hydrodynamically transfected mice. J Gene Med, 2011, 13(7/8)：365–372.