日本腦炎病毒NS3蛋白酶活性檢測(cè)及抑制劑高通量篩選方法的建立

周景云，汪雪，裴超，宋云峰，陳煥春1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

日本腦炎病毒NS3蛋白酶活性檢測(cè)及抑制劑高通量篩選方法的建立

周景云1,2，汪雪2，裴超2，宋云峰1,2，陳煥春1,2
1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070

日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 是單股正鏈RNA病毒，全基因組僅含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼一條多聚蛋白前體，病毒編碼的NS3蛋白酶在JEV多聚蛋白加工過(guò)程中起著重要作用，是重要的藥物靶標(biāo)。通過(guò)PCR擴(kuò)增了NS2BH-NS3蛋白酶的編碼區(qū)，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到可溶性的NS3蛋白酶，用鎳親和層析方法進(jìn)行了純化。建立了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的NS3蛋白酶活性檢測(cè)方法，并確定了最佳的反應(yīng)條件，對(duì)113個(gè)化合物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)化合物對(duì)JEV NS3蛋白酶具有一定的抑制活性。本研究為JEV NS3蛋白酶的活性研究及抑制劑篩選提供了一種操作方便、成本低廉的方法。

日本腦炎病毒，NS3蛋白酶，可溶性表達(dá)，酶活性，抑制劑高通量篩選

日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 是由蚊蟲(chóng)媒介傳播的嗜神經(jīng)病毒，為黃病毒科黃病毒屬成員之一。JEV主要在亞洲流行并造成較大的危害[1-2]，其感染豬后導(dǎo)致母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，公豬多發(fā)生睪丸炎，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。同時(shí)JEV可感染人引起急性腦炎，造成較高的致死率和致畸率，嚴(yán)重威脅人類的健康[4-6]。2006年，日本腦炎病毒在我國(guó)山西運(yùn)城流行，導(dǎo)致66人感染，其中19人死亡[7]，造成了較大的社會(huì)影響。盡管目前有商業(yè)化的日本腦炎病毒疫苗[8-9]，但還沒(méi)有有效的藥物和特異性療法來(lái)治療JEV感染。因此尋求特異性針對(duì)JEV的藥物和治療方法具有重要的意義[10]。

JEV NS3的N端180個(gè)氨基酸與NS2B形成二聚體，具有絲氨酸蛋白酶功能[11-12]。JEV基因組僅編碼一個(gè)開(kāi)放閱讀框，翻譯為一條聚蛋白[13]，聚蛋白的切割是依靠各種蛋白酶完成的，其中NS3蛋白酶負(fù)責(zé)切割大部分區(qū)域，包括C-prM、NS2A-NS2B、NS2B-NS3、NS3-NS4A、NS4A-NS4B、NS4B-NS5等，其他位置由弗林蛋白酶和一些未知蛋白酶進(jìn)行切割[14]。JEV NS3蛋白酶的活性位點(diǎn)主要由NS3中His51、Asp75、Ser135三個(gè)氨基酸形成催化三角體[15]，這3個(gè)氨基酸在絲氨酸蛋白酶中高度保守。NS2B的膜外區(qū)與NS3相互結(jié)合，使底物易于進(jìn)入其催化位點(diǎn)[16]。由于JEV NS3蛋白酶在病毒復(fù)制周期中的重要功能，且其與宿主蛋白酶的同源性低，因此已成為黃病毒中具有潛力的藥物靶標(biāo)。本研究在原核細(xì)胞中表達(dá)了可溶的NS3蛋白酶，用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法建立了酶活性檢測(cè)方法[17]，并在微孔板中建立了基于蛋白酶活性的抑制劑篩選方法，進(jìn)行了初步應(yīng)用。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET-30a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素購(gòu)自默克公司。酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。Aprotinin、咪唑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，Tris-base和甘氨酸購(gòu)自AMERSCO公司。用于酶抑制活性篩選的化合物購(gòu)自Specs公司。

1.2 方法

1.2.1 NS2B-NS3基因的擴(kuò)增

根據(jù)NS2B和NS3基因的序列，設(shè)計(jì)并合成PCR引物，引物的序列見(jiàn)表1。

應(yīng)用重疊PCR方法擴(kuò)增NS3蛋白酶基因。提取JEV RNA后，分別以NS2BH-s和NS2BH-liner-a，Protease-Linker-s和NS3-a為引物，擴(kuò)增出所需要的目的基因，將兩次PCR的產(chǎn)物回收并混合。從混合物中取出1 μL為模板，以NS2BH-s、NS3-a為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的片段。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)純化

將回收的PCR產(chǎn)物與pET-30a載體同時(shí)用BamH I、Xho I雙酶切后在16 ℃連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌株，雙酶切法鑒定陽(yáng)性克隆，所得的陽(yáng)性克隆經(jīng)DNA測(cè)序正確后將其轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)中，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-30a-NS2BH-NS3。

將轉(zhuǎn)化pET-30a-NS2BH-NS3質(zhì)粒的BL21 (DE3)細(xì)菌接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，18 ℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h后收集菌體，壓力破碎，離心后取上清后，用鎳親和層析方法進(jìn)行純化。

1.2.3 蛋白酶活性測(cè)定的底物設(shè)計(jì)和合成

本研究中采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法(FRET) 建立蛋白酶活性的測(cè)定方法，設(shè)計(jì)一段NS3蛋白酶可識(shí)別并切割的多肽，在N端標(biāo)記熒光基團(tuán)，在C端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。該多肽完整時(shí)熒光被淬滅，加入蛋白酶后，多肽被切割，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，因而體系中可檢測(cè)到熒光。設(shè)計(jì)的底物序列為：Dabcyl-KQNKRGGNE(EDANS)G。

1.2.4 NS3蛋白酶的酶反應(yīng)曲線

在黑色96孔板中依次加入60 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，30 μL 20 μmol/L NS2BH-NS3純化蛋白，10 μL 100 μmol/L熒光底物，水平振蕩1 min后，置于37 ℃反應(yīng)，每隔20 min測(cè)定340 nm激發(fā)光下的發(fā)射光 (485 nm)，并繪制酶反應(yīng)曲線。

1.2.5 NS3蛋白酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

1) pH對(duì)NS3蛋白酶活性的影響：在96孔板中依次加入50 μL 2×pH 緩沖液、30 μL NS2BH-NS3純化蛋白、10 μL熒光底物、10 μL去離子。其中2×pH 緩沖液的pH值分別為7.0–11.0。測(cè)定加樣后0 min、120 min的熒光值，比較不同pH值條件下酶反應(yīng)變化。

2) 二價(jià)金屬離子對(duì)NS3蛋白酶活性的影響：在NS3蛋白酶反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為5 mmol/L CaCl2、3 mmol/L MgSO4或3 mmol/L MgCl2，測(cè)定蛋白酶反應(yīng)變化 (反應(yīng)條件同上) ，比較不同二價(jià)離子對(duì)酶反應(yīng)的影響。

3) NaCl濃度對(duì)NS3蛋白酶活性的影響：在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L NaCl，置于37 ℃反應(yīng)，反應(yīng)條件同上，比較蛋白酶活性的變化。

1.2.6 NS3蛋白酶米氏常數(shù) (Km) 和最大反應(yīng)速度 (Vmax) 的測(cè)定

在反應(yīng)最佳條件下，在反應(yīng)體系中加入不同終濃度的底物 (0–80 mmol/L)，測(cè)定反應(yīng)初速度，根據(jù)米氏方程求得JEV NS3蛋白酶的Km和Vmax。

1.2.7 基于NS3蛋白酶活性的抑制劑篩選方法的建立

在黑色96孔酶標(biāo)板中依次加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，20 μmol/L NS2BH-NS3，100 μmol/L熒光底物，1 mmol/L抑肽酶(Aprotinin)，總體積100 μL。加樣后立即置于多功能酶標(biāo)儀中，37 ℃振蕩1 min后，測(cè)定反應(yīng)零時(shí)間發(fā)射光 (F0)。將96孔板置于37 ℃溫箱中反應(yīng)120 min后，再次用酶標(biāo)儀檢測(cè)體系中的熒光強(qiáng)度 (F1)。設(shè)置不加化合物的對(duì)照組，并測(cè)定反應(yīng)后0 min (F0c) 和120 min (F1c) 的熒光值。抑制率(%)=100- (F1-F0) ÷ (F1c-F0c) ×100。

1.2.8 NS3蛋白酶抑制劑高通量篩選方法的初步應(yīng)用

用上述建立的NS3蛋白酶抑制劑高通量篩選方法，隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室保存的113種化合物進(jìn)行了初步篩選的應(yīng)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS2BH-NS3基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用引物NS2BH-s/NS2BH-liner-a、Proteaselinker-s/Protease-a，通過(guò)RT-PCR方法分別從JEV基因組中擴(kuò)增出約170 bp和570 bp的兩個(gè)片段，再通過(guò)SOE-PCR擴(kuò)增出約740 bp大小的一個(gè)片段。將擴(kuò)增的目的片段插入原核表達(dá)載體后，雙酶切后得到大小約為5 000 bp和740 bp的兩個(gè)片段 (圖1)，證明重組質(zhì)粒pET30a-NS2BH-NS3構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果也表明構(gòu)建正確。

圖1 質(zhì)粒pET30a-NS2BH-NS3的酶切鑒定Fig. 1 Identification of plasmid pET30a-NS2BH-NS3. M: DL5000; 1-2: pET30a-NS2BH-NS3.

圖2 重組蛋白NS2BH-NS3的SDS-PAGE鑒定Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified NS2BHNS3. M: protein marker; 1-4: purified protein.

圖3 NS3蛋白酶反應(yīng)曲線Fig. 3 Reaction curve of NS3 protease.

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化

活化的表達(dá)菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD值0.6，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，在18 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后收集菌體，破碎，純化。蛋白表達(dá)及純化結(jié)果如圖2所示，蛋白總分子量為36 kDa，同時(shí)，NS2BH-NS3蛋白可自我剪切成NS2BH (14 kDa) 和NS3 (22 kDa) 兩條帶 (圖2)。

2.3 NS3蛋白酶的酶反應(yīng)曲線

將純化的NS3蛋白酶與合成的FRET底物混合后，置于多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)置溫度37 ℃進(jìn)行反應(yīng)，每隔20 min測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，共測(cè)定10次。從測(cè)定結(jié)果看 (圖3)，隨著酶反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，體系中的熒光強(qiáng)度不斷增加，經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，體系中熒光強(qiáng)度的增加與時(shí)間成明顯的線性相關(guān) (R2=0.9978)，說(shuō)明在200 min內(nèi)該蛋白酶反應(yīng)均處于一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速度恒定。

2.4 NS3蛋白酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 pH對(duì)NS3蛋白酶活性的影響

在不同pH (7.5–11.0) 緩沖液中，加入NS3蛋白和FRET底物，于37 ℃反應(yīng)120 min后，測(cè)定體系熒光值，計(jì)算反應(yīng)初速度。從圖4中可見(jiàn)，在pH 9.5時(shí)蛋白酶活性最高，而在pH 7.5時(shí)蛋白酶的活性最低 (圖4)。因此確定了NS3蛋白酶催化反應(yīng)的最佳pH為9.5。

2.4.2 二價(jià)金屬離子對(duì)NS3蛋白酶活性的影響

在蛋白酶反應(yīng)體系中加入不同的二價(jià)金屬離子 (5 mmol/L CaCl2、3 mmol/L MgSO4、3 mmol/L MgCl2)，在pH 9.5下測(cè)定反應(yīng)的初速度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)體系中加入金屬離子后會(huì)影響NS3蛋白酶的活性 (圖5)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，JEV NS3蛋白酶活性不需要二價(jià)金屬離子，相反在酶反應(yīng)中二價(jià)金屬離子會(huì)抑制酶活性。

2.4.3 NaCl濃度對(duì)NS3蛋白酶活性的影響

在酶反應(yīng)體系中分別加入0–250 mmol/L NaCl，按照上述方法測(cè)定蛋白酶反應(yīng)初速度。結(jié)果顯示，NaCl對(duì)酶反應(yīng)具有不利影響，隨反應(yīng)緩沖液中NaCl濃度的升高，NS3蛋白酶的活性越弱 (圖6) 。因?yàn)樵跓o(wú)鹽離子時(shí)，NS3蛋白易于沉淀，因此在反應(yīng)體系中我們加入了10 mmol/L NaCl。

圖4 pH對(duì)NS3蛋白酶活性的影響Fig. 4 Effect of pH on the activity of NS3 protease. RFU: fluorescence units.

圖5 二價(jià)金屬離子對(duì)NS3蛋白酶活性的影響Fig. 5 Effect of divalent metal ions on the activity of NS3 protease. RFU: fluorescence units.

圖6 不同NaCl濃度對(duì)NS3蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effect of NaCl concentration on the activity of NS3 protease. RFU: fluorescence units.

2.5 NS3蛋白酶Km和Vmax的測(cè)定

根據(jù)上述最適反應(yīng)條件的摸索，確定NS3蛋白酶活性測(cè)定的條件為：37 ℃，pH 9.5，10 mmol/L NaCl。在該條件下，加入不同濃度的底物測(cè)定反應(yīng)初速度，用雙倒數(shù)作圖法得出NS3蛋白酶的米氏常數(shù) (Km) 為59.28 μmol/L (圖7)，最大反應(yīng)速度 (Vmax) 為500 Fluorescence units/min。

2.6 基于NS3蛋白酶活性的抑制劑篩選方法建立

將不同濃度 (10–50 μmol/L) 的蛋白酶抑制劑Aprotinin加入蛋白酶反應(yīng)體系，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定加Aprotinin后0 min、120 min的熒光值，并計(jì)算抑制率。發(fā)現(xiàn)Aprotinin對(duì)NS2BH-NS3活性有抑制作用，并隨濃度減少抑制效果減弱 (圖8)。

圖7 NS3蛋白酶的Km和Vmax值的測(cè)定Fig. 7 Kinetic parameters (Km, Vmax) of JEV NS3 protease.

圖8 Aprotinin對(duì)NS3蛋白酶活性的抑制作用Fig. 8 Inhibition of Aprotinin on NS3 protease activity.

圖9 81#化合物對(duì)NS3蛋白酶活性的抑制作用Fig. 9 Inhibition of 81# compound on NS3 protease activity.

圖10 92#化合物對(duì)NS3蛋白酶活性的抑制作用Fig. 10 Inhibition of 92# compound on NS3 protease activity.

2.7 NS3蛋白酶抑制劑高通量篩選方法的初步應(yīng)用

在黑色96孔板中，對(duì)113個(gè)化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)化合物的抑制率均在20%–40%，其中2種化合物對(duì)NS3蛋白酶具有一定抑制活性，兩個(gè)化合物在濃度為0.5 mmol/L時(shí)，抑制率分別為73%和71%。進(jìn)一步將2種化合物在不同濃度下測(cè)定了抑制率，發(fā)現(xiàn)兩種化合物對(duì)NS3蛋白酶的抑制呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著化合物濃度的降低抑制率也下降 (圖9、10)。兩種化合物的結(jié)構(gòu)式如圖11所示。

3 討論

JEV NS3蛋白酶的活性依賴于NS2B的40個(gè)氨基酸的激活作用，NS2B與NS3蛋白酶識(shí)別底物有關(guān)，主要決定結(jié)合的親和力[18]，起著輔因子的作用。此外，NS2B的疏水區(qū)域與NS2B-NS3復(fù)合物的膜定位有關(guān)[19]。NS2B-NS3蛋白酶識(shí)別剪切雙堿性殘基序列RR、KK和RK，該序列在整個(gè)黃病毒屬蛋白酶中高度保守，因此NS3蛋白酶被公認(rèn)為潛在的治療乙腦的良好靶標(biāo)。目前針對(duì)HCV的NS3蛋白酶為靶標(biāo)篩選出的波普瑞韋和特拉匹韋，均于2011年5月通過(guò)了美國(guó)FDA的上市許可。針對(duì)JEV NS3蛋白酶及其抑制劑的研究幾乎還沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)JEV NS3蛋白酶進(jìn)行體外表達(dá)和活性研究，并用表達(dá)的蛋白對(duì)化合物進(jìn)行抑制劑篩選從而為設(shè)計(jì)篩選基于蛋白酶靶標(biāo)的JEV藥物奠定了基礎(chǔ)。

以往建立的蛋白酶活性的檢測(cè)方法主要有放射性同位素法和高效液相色譜法。放射性同位素法較為靈敏，但操作度復(fù)雜，有放射性的污染，因此不適合進(jìn)行高通量操作。高效液相色譜測(cè)定法要求抑制劑的純度高[20]，而且此方法也不適合大量藥物篩選[21]。本實(shí)驗(yàn)使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法檢測(cè)酶活性并大量篩選藥物[22]，此方法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍很廣，成本低，并且可以進(jìn)行高通量抑制劑篩選[23]，但是在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)一些化合物本身帶熒光，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，可能產(chǎn)生一定的假陽(yáng)性或假陰性，需要在分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)予以辨別。

圖11 兩種苗頭化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 11 Structures of the two hit compounds.

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Method for Japanese encephalitis virus NS3 protease activity analysis and high-throughput screening assay for inhibitors

Jingyun Zhou1,2, Xue Wang2, Chao Pei2, Yunfeng Song1,2, and Huanchun Chen1,2
1 State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China 2 College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Japanese encephalitis virus (JEV) is a single-stranded and positive-sense RNA, which has a single ORF (open reading frame), encoding a polyprotein precursor. Non-structural protein 3 (NS3) plays an important role in processing the polyprotein precursor and has become an important drug target of flavivirus. In this study, NS2BH-NS3 gene was amplified by PCR and subcloned to the prokaryotic expression plasmid, resulting pET30a-NS2BH-NS3. The fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) in soluble form after induction by Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG). The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity column. Then a fluorescence resonance energy transfer (FRET) method was used to determine enzymatic activity and the assay conditions were optimized. After screening 113 compounds, we found two compounds inhibiting the activity of NS2BH-NS3. This study provides a convenient and cost-effective method for screening of JEV NS3 protease inhibitor.

Japanese encephalitis virus, NS3 protease, solubility expression, activity analysis, high throughput screening for inhibitors

May 6, 2013; Accepted: August 19, 2013

Yunfeng Song. Tel: +86-27-87617277; Fax: +86-27-87288629; E-mail: syf8728@163.com

周景云, 汪雪, 裴超, 等. 日本腦炎病毒NS3蛋白酶活性檢測(cè)及抑制劑高通量篩選方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 194-202.

Zhou JY, Wang X, Pei C, et al. Method for Japanese encephalitis virus NS3 protease activity analysis and high-throughput screening assay for inhibitors. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 194-202.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30800831), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A212).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30800831)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2011AA10A212) 資助。

時(shí)間：2013-10-11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131011.1835.002.html