利用梯度平板法結(jié)合紫外誘變、抗性篩選選育土霉素高產(chǎn)菌株

王小娟，張萍，逄春梅，石彥鵬

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

利用梯度平板法結(jié)合紫外誘變、抗性篩選選育土霉素高產(chǎn)菌株

王小娟，張萍，逄春梅，石彥鵬?

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

以龜裂鏈霉素TMSⅠ12－66為出發(fā)菌株，通過紫外－氯化鋰誘變處理，并結(jié)合梯度平板法、氯化鋰和四環(huán)素復(fù)合抗性平板上篩選土霉素高產(chǎn)菌株。通過對致死率的考察，確定了紫外的最佳誘變劑量為90 s。在分離培養(yǎng)基上層加入氯化鋰和底層加入四環(huán)素進行正突變株的定向篩選。經(jīng)過選育得到一株土霉素的高產(chǎn)菌株TMSⅠ14－180，搖瓶發(fā)酵驗證效價達22985 mg／mL，較出發(fā)菌株提高22.36%，經(jīng)傳代試驗考察，該菌株遺傳性狀穩(wěn)定。

龜裂鏈霉菌；紫外誘變；抗性篩選

土霉素是一種四環(huán)素類廣譜抗生素，抗菌譜廣，在醫(yī)療和畜牧業(yè)上廣泛應(yīng)用。土霉素的產(chǎn)生菌龜裂鏈霉菌經(jīng)過長期多次的常規(guī)誘變處理，其處理效果已不明顯。常規(guī)誘變方法所產(chǎn)生的突變是隨機的，雖然其突變頻率高，但無方向性，導(dǎo)致目標(biāo)菌株篩選工作量大，影響選育效率。鏈霉菌產(chǎn)抗生素能力與抗生素抗性基因之間的對應(yīng)關(guān)系也是目前抗生素科研領(lǐng)域的一個研究熱點［1－2］?？剐院Y選是利用微生物對某些抗生素的耐藥性，在菌種選育中對大量突變株進行有目的的篩選，有利于抗生素產(chǎn)量的提高［3］，從而高效地得到目的菌株。該篩選方法操作簡單、周期短、安全性好［3－5］，能夠直接影響微生物產(chǎn)抗生素的調(diào)控系統(tǒng)，從而使抗性篩選在抗生素高產(chǎn)菌的選育中得到廣泛應(yīng)用［4］。利用紫外線和氯化鋰誘變的方法以及兩種方法合用或與其他誘變方法合用已是篩選突變株的常用方法［6－7］。氮離子注入［8］、亞硫酸氫鈉［9］和各種方法聯(lián)用的復(fù)合誘變方法［10］也應(yīng)用廣泛，但各種方法都有其不足，搖瓶效價提高也有限。此外，抗結(jié)構(gòu)類似物菌株篩選、抗性篩選技術(shù)也已引起人類的注意［11－13］。本方法結(jié)合采用紫外誘變、氯化鋰誘變以及抗結(jié)構(gòu)類似物抗性篩選，結(jié)合了各種誘變方法的優(yōu)點，既提高了菌種突變頻率，又克服了篩選的盲目性和不定向性，使得篩選出來的突變株搖瓶效價大幅提高。

1 材料和方法

1.1 菌株 龜裂鏈霉菌TMSⅠ12－66，寧夏泰瑞制藥股份有限公司保存。

1.2 主要試劑 氯化鋰，天津市凱通試劑有限公司；四環(huán)素，湖北巨勝科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基［14］（包括分離培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基）：玉米淀粉、碳酸鈣、硫酸銨、氯化鈉、玉米漿。種瓶培養(yǎng)基：玉米淀粉、黃豆餅粉、碳酸鈣、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉、黃豆餅粉、碳酸鈣、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿、淀粉酶、消沫劑。

1.4 方法

1.4.1 單孢子懸浮液的制備 取一支成熟斜面，加入20 mL無菌水，用接種鏟輕輕刮下孢子。將孢子液倒入無菌且裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，震蕩、過濾，即得單孢子懸浮液，用無菌水稀釋使懸浮液的孢子濃度為107～108個／mL。

1.4.2 紫外誘變 取一定量的孢子懸浮液到培養(yǎng)皿中，放入紫外誘變箱內(nèi)的磁力攪拌器上，開啟紫外燈（30 w），距離30 cm，邊照射邊攪拌。照射0、30、60、90、120、150和180 s后，稀釋，涂布。同時設(shè)置未經(jīng)過誘變的對照組，（37.0±0.5）℃，濕度30%～60%［14］避光培養(yǎng)，培養(yǎng)110～145 h后，記錄各組平皿上單菌落形態(tài)及數(shù)量，并計算致死率。

1.4.3 LiCl助誘變劑 氯化鋰是一種化學(xué)誘變劑，更是一種助誘變劑，可導(dǎo)致AT－CG堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或使堿基缺失，從而導(dǎo)致代謝途徑等發(fā)生變化，最終產(chǎn)生高產(chǎn)菌株。將未誘變過的菌液涂布于只含有氯化鋰的平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，考察不同濃度（2、3、4、5、6 g／L）氯化鋰對致死率的影響。

1.4.4 四環(huán)素抗性篩選 龜裂鏈霉素孢子四環(huán)素最小抑制濃度（MIC）測定［4］：將制備好的孢子懸液分別涂布于含有不同濃度（3000、3500、4000、4500、5000 mg／L）四環(huán)素的培養(yǎng)基平板上，（37.0±0.5）℃，濕度30%～60%條件下培養(yǎng)110～145 h，觀察平板上單菌落生長情況。生長菌落但未長出孢子的平板上的四環(huán)素濃度即為四環(huán)素最小抑制濃度（MIC）。

1.4.5 梯度平板制備 梯度平板法是篩選抗藥性突變型的一種有效簡便方法，其操作要點是：先加入含有一定濃度氯化鋰的培養(yǎng)基，立即把培養(yǎng)皿斜放，待培養(yǎng)基凝固后形成一個斜面，再將培養(yǎng)皿平放，倒入含最小抑制濃度四環(huán)素的培養(yǎng)基，這樣就形成一個藥物濃度梯度由濃到稀的梯度培養(yǎng)基。

1.4.6 四環(huán)素抗性突變株的分離 將紫外線照射過且稀釋好的孢子懸液分別涂布于含有氯化鋰和最小抑制濃度四環(huán)素的氯化鋰－四環(huán)素梯度平板上，避光（37.0±0.5）℃培養(yǎng)110～145 h。該培養(yǎng)基上生長出來的菌落即為四環(huán)素抗性突變株。

1.4.7 抗性菌株斜面的制備 將氯化鋰－四環(huán)素梯度平板上生長較好、孢子較豐滿的單菌落用玻璃棒挑取到加有四環(huán)素的斜面培養(yǎng)基上，（37.0±0.5）℃，濕度40%～55%培養(yǎng)70～85 h；（30.0±0.5）℃，25%～65%濕度下培養(yǎng)20～30 h。

1.4.8 抗性突變株搖瓶發(fā)酵實驗 用接種鏟鏟取2～3 cm2生長好的孢子斜面接種于種瓶培養(yǎng)基中，裝量40 mL／300 mL三角瓶，溫度（30.0±0.5）℃，濕度40%～55%，220～230 r／min培養(yǎng)26～28 h。待生長成熟后將2 mL種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵瓶裝量40 mL／300 mL三角瓶，（30.0±0.5）℃，濕度40%～55%，220～230 r／min培養(yǎng)168～195 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變致死率曲線 結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫外誘變致死率曲線圖

由圖1可以看出，隨著紫外照射時間的延長，致死率逐漸升高，當(dāng)誘變時間為90 s左右時，致死率達90%以上。一般認為死亡率較高時誘變效果較好，但也有報道稱，較低的致死率有利于正突變菌株的產(chǎn)生。本實驗選用致死率為90.3%的90 s作為紫外誘變劑量。

2.2 LiCl實驗 不同氯化鋰濃度對菌株的致死率見表1，說明單獨使用氯化鋰對菌株致死率很低，不能達到誘變目的。

表1 LiCl濃度對菌株致死率的影響結(jié)果表

2.3 四環(huán)素最小抑制濃度 結(jié)果見表2。

經(jīng)試驗驗證，確定四環(huán)素對龜裂鏈霉菌TMSⅠ12－66菌株的孢子最小抑制濃度為4500 mg／L。

表2 四環(huán)素濃度對單菌落的影響結(jié)果表

2.4 抗性突變株篩選 制備孢子懸液，將懸液先進行紫外誘變（90 s），再將誘變過的菌懸液稀釋至10－4、10－5、10－6濃度，涂布于氯化鋰－四環(huán)素復(fù)合梯度培養(yǎng)基上，避光（36.5±1.0）℃培養(yǎng)5 d。

在梯度平板上共分離得到193株抗性菌株，通過初篩（每組設(shè)置3個平行樣）獲得21株效價高于對照菌株的突變株。再將21株突變菌進行兩次復(fù)篩（每組設(shè)置3個平行樣），其結(jié)果見表3。

根據(jù)三次復(fù)篩結(jié)果選出效價較高的三株菌TMSⅠ14－114、TMSⅠ14－180、TMSⅠ14－182進行傳代穩(wěn)定性實驗。

表3 抗性突變株復(fù)篩結(jié)果表

2.5 突變株穩(wěn)定性實驗 將復(fù)篩結(jié)果較理想的3株菌在沒有抗性的平板上連續(xù)傳代，考察其斜面穩(wěn)定性。傳代5次后進行搖瓶發(fā)酵驗證實驗，驗證至少3次。穩(wěn)定性實驗結(jié)果見圖2。

圖2 突變株穩(wěn)定性實驗

由圖2可知三株突變株中TMSⅠ14－180較穩(wěn)定。試驗結(jié)果分析見表4。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果分析表

由表4可知，變異系數(shù)可表示其變異程度的大小，三株菌中TMSⅠ14－114的變異系數(shù)為7.87%，TMSⅠ14－180的變異系數(shù)為2.11%，TMSⅠ14－182的變異系數(shù)為6.12%。由數(shù)據(jù)可知TMSⅠ14－180的變異系數(shù)最小，且從斜面外觀來看其菌落形態(tài)較規(guī)則、孢子也較豐滿，故認為該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論與小結(jié)

3.1 在本次菌種選育過程中，利用紫外＋氯化鋰誘變結(jié)合抗生素抗性篩選法，克服了篩選的盲目性和不定向性，大大減少了篩選的工作量，提高了菌種選育效率。抗生素的生物合成途徑可能會通過分支途徑收到嚴格的反饋抑制，僅能合成一定量的抗生素，因此需要一個遺傳上改變調(diào)節(jié)機制的突變株。篩選結(jié)構(gòu)類似物突變株是使相關(guān)酶的調(diào)節(jié)基因或變構(gòu)酶的基因發(fā)生突變，使結(jié)構(gòu)類似物不能再與阻遏物或變構(gòu)酶結(jié)合，即結(jié)構(gòu)類似物不再抑制突變株的生長或產(chǎn)物的合成，反饋調(diào)節(jié)被解除，從而大量合成產(chǎn)物［11－12］。四環(huán)素為土霉素的結(jié)構(gòu)類似物，利用該方法獲得的菌株化學(xué)效價提高幅度較大，同時也證明了該選育方法的有效性。

3.2 有大量報道稱抗生素抗性基因可能與抗生素結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因存在著一定的聯(lián)系［15］，抗生素產(chǎn)生菌中的抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因緊密連鎖，可發(fā)生共突變，即抗性突變總是伴隨著產(chǎn)量突變［16］，這也從理論上支持了該選育方法的可行性。可用此方法繼續(xù)對土霉素產(chǎn)生菌進行誘變，期望得到性狀更優(yōu)良的高產(chǎn)菌株。

通過紫外誘變結(jié)合抗性篩選并利用梯度平板法處理龜裂鏈霉菌，從大量單菌落中經(jīng)過初篩、復(fù)篩得到高產(chǎn)土霉素的3株抗性突變株，分別為TMSⅠ14－114、TMSⅠ14－180、TMSⅠ14－182，其化學(xué)效價分別為22787、22985和23083 mg／mL，分別比出發(fā)菌株提高21.30%、22.36%和22.88%。再通過傳代穩(wěn)定性試驗確定了菌株TMSⅠ14－180具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

本次設(shè)計采用紫外＋氯化鋰誘變結(jié)合抗底物的結(jié)構(gòu)類似物的篩選法，與其他報道的試驗方法相比，既提高了菌種突變頻率，又克服了篩選的盲目性和不定向性。另外結(jié)合梯度平板法選擇抗生素濃度，使實驗工作量和實驗時間都大大減少，從而提高了菌種選育效率。

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（編輯：侯向輝）

Breeding High－yielding Strains of Oxytetracycline with UV Mutagenesis，Oxytetracycline Resistance Screening and Gradient Plate Method

WANG Xiao－juan，ZHANG Ping，PANG Chun－mei，SHI Yan－peng?
（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co Ltd，Yinchuan 750101，China）

UV mutagenesis，antibiotics resistance screening and gradient plate method were used to screen highyielding strains of oxytetracycline directionly by using Streptomyces rimosus TMSⅠ12－66 as the original strain.The results showed that the dose of UV irradiation was determined 90 s in term of death rate.Using isolation medium with lithium chloride on the upper layer and tetracycline on the bottom layer，a high－yield oxytetracycline－producing strain named TMSⅠ12－66 was obtained，whose shaking production reached 22985 mg／mL，increased by 22.36%than the original strain，its character was stable after five generations.

Streptomyces rimosus；UV mutagenesis；resistance screening

2014－09－15

A

1002－1280（2014）11－0024－05

S852.61

王小娟，碩士，從事抗生素發(fā)酵育種研究。

石彥鵬。E－mail：shiyanpeng＠tairuiworld.com