基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析

游 泳，杜瑩瑩，曹 媛，李真珍，張勝軍

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南 鄭州 450052;2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 河南 鄭州 450052)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，早期就可經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者預(yù)后不佳的主要原因，如何有效控制宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是當(dāng)前亟待解決的課題。有報道稱，腫瘤侵襲正常組織及轉(zhuǎn)移必須突破細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)，在ECM成分降解過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)發(fā)揮了重要作用［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissu inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)是MMPs特異性抑制物，抑制MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的活性［2］。目前，已有少量文獻(xiàn)報道MMPs和TIMPs與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［3］，但其在宮頸癌中確切的表達(dá)情況及其與臨床分期、臨床分級、間質(zhì)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的關(guān)系尚不完全清楚，且有關(guān) MMP-2、MMP-9和 TIMP-2、TIMP-1聯(lián)合檢查及表達(dá)研究較少。本研究通過分析MMP-2、MMP-9和TIMP-2、TIMP-1在宮頸癌中表達(dá)情況，探討其與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛能評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年6月至2013年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實的早期宮頸浸潤癌患者108例(ICC組)。年齡36～72歲，平均(60.6±5.2)歲。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰa期22例、Ⅰb期24例、Ⅱa期28例、Ⅱb期34例;組織學(xué)分級:G122例、G230例、G356例。鏡下早期浸潤18例、間質(zhì)浸潤90例;病理學(xué)類型:鱗癌81例、腺癌27例;伴有脈管浸潤33例、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。另選取同期行子宮全切或?qū)m頸錐切的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)患者65例(CIN組)。年齡33～74歲，平均(57.2±6.1)歲。同時取同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織標(biāo)本40例為對照組，年齡35～61歲，平均(52.5±5.8)歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，患者均未合并結(jié)締組織病和免疫系統(tǒng)疾病，術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫、冷凍和激光等治療。

1.2 方法 取ICC組和CIN組切除的病變組織標(biāo)本2份;對照組任取宮頸組織2份。標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后，1份行常規(guī)病理檢查確診，1份置于－70℃冰箱中保存待檢。取待檢標(biāo)本置于離心管中剪碎，采用Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，應(yīng)用RT-PCR試劑盒(購自上海生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-action為內(nèi)參照，與目的基因同一程序同時擴(kuò)增。94℃變性 45 min，60℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，后溴化乙錠(0.5 mg/ml)染色。紫外線觀測儀檢查有無特異條帶并攝影，有目的基因條帶及內(nèi)參條帶者為陽性表達(dá)，只有內(nèi)參條帶者為陰性表達(dá)，用圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)進(jìn)行圖像掃描分析。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物含量以MarkerⅠ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，目的基因mRNA表達(dá)水平=目的基因的灰度值/β-action的灰度值×100%。目的基因和β-action基因序列見表1。

表1 目的基因和β-action基因序列

1.3 參數(shù)記錄和比較 記錄RT-PCR檢測各個因子(MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2)的表達(dá)水平;比較ICC組、CIN組和對照組各因子表達(dá)情況差異。同時記錄ICC組患者年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級、大體類型、組織類型、分化程度、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度等臨床病理情況，分析臨床病理參數(shù)與各因子表達(dá)水平的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料以()表示，采用的統(tǒng)計學(xué)方法為兩隨機(jī)樣本t檢驗和方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)因子的表達(dá)水平比較 ICC組MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于CIN組和對照組，TIMP-2和TIMP-1的表達(dá)水平顯著低于CIN組和對照組(P＜0.05)。CIN組MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于對照組，TIMP-2和TIMP-1的表達(dá)水平顯著低于對照組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組相關(guān)因子表達(dá)水平比較()

表2 各組相關(guān)因子表達(dá)水平比較()

＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 n 88 ±12.17 CIN 組 65 73.57 ±17.51 75.68 ±17.15 92.82 ±18.62 91.23 ±19.74對照組 40 35.59 ±9.82 37.26 ±10.54 108.25 ±23.93 110.16 ±22.42 F 163.02 158.33 107.15 126.00 P MMP-2 MMP-9 TIMP-2 TIMP-1 ICC 組 108 96.75 ±21.23 94.27 ±19.35 66.51 ±11.96 63.

2.2 臨床病理參數(shù)與相關(guān)因子表達(dá)水平的關(guān)系

ICC組中，Ⅱ期、G3級、低分化、有脈管浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有間質(zhì)浸潤的患者M(jìn)MP-2和MMP-9的表達(dá)水平分別顯著高于Ⅰ期、G1-G2級、中-高分化、無脈管浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無間質(zhì)浸潤的患者(P＜0.05)，而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平分別顯著低于Ⅰ期、G1-G2級、中-高分化、無脈管浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無間質(zhì)浸潤的患者(P＜0.05)。各因子的表達(dá)水平在不同大體類型、不同組織類型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 臨床病理參數(shù)與ICC組相關(guān)因子表達(dá)水平的關(guān)系()

表3 臨床病理參數(shù)與ICC組相關(guān)因子表達(dá)水平的關(guān)系()

病理參數(shù) n MMP-2 MMP-9 TIMP-2 TIMP-1分期Ⅰ期 46 87.45 ±17.52 83.84 ±16.85 75.46 ±10.14 73.27 ±10.24Ⅱ期 62 103.24 ±19.11 100.57 ±18.19 58.25 ±9.85 55.61 ±9.52分級G1-G2 52 88.87 ±17.41 86.15 ±16.14 76.23 ±10.02 72.86 ±9.94 G3 56 104.51 ±18.32 101.68 ±17.87 57.83 ±9.78 56.03 ±9.45大體類型內(nèi)生型 45 95.27 ±20.87 90.09 ±19.27 68.08 ±11.98 66.98 ±12.12外生型 63 97.89 ±21.15 95.74 ±19.30 65.42 ±11.84 61.98 ±12.08組織類型鱗癌 81 97.28 ±20.75 94.85 ±19.44 66.12 ±11.52 63.38 ±12.24腺癌 27 94.89 ±20.98 92.46 ±19.13 68.57 ±11.43 65.98 ±12.03分化程度低分化 40 106.75 ±19.89 105.17 ±18.78 57.37 ±9.24 56.24 ±9.38中-高 68 90.42 ±17.87 88.58 ±17.42 76.42 ±10.52 69.56 ±9.85脈管浸潤是33 103.46 ±19.13 103.25 ±19.14 56.82 ±10.05 53.28 ±9.74否75 93.78 ±18.25 90.41 ±17.87 72.34 ±10.81 68.64 ±10.26淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是27 113.42 ±20.42 111.48 ±20.89 51.54 ±9.06 50.87 ±8.98否81 91.53 ±18.62 89.54 ±18.45 70.53 ±9.98 67.58 ±9.56間質(zhì)浸潤是90 99.23 ±19.42 97.64 ±19.47 62.57 ±9.26 60.54 ±9.14否18 82.47 ±17.98 79.82 ±17.85 82.43 ±10.15 78.55 ±9.86

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，位居生殖器官腫瘤死因的首位。雖然以手術(shù)、化療和放療為主的綜合療效有所提高，但宮頸癌的轉(zhuǎn)移、侵襲和預(yù)后不良仍是難題。如何有效預(yù)測宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，對制定正確的治療方案及判斷預(yù)后具有重要的意義。不過目前尚未發(fā)現(xiàn)具有特異性的生物學(xué)指標(biāo)可有效預(yù)測宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。

MMPs在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMPs通過降解ECM，破壞基底膜屏障及局部的組織結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞浸潤周圍組織，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;同時MMPs具有促進(jìn)新生血管形成的作用，為腫瘤細(xì)胞的侵潤和轉(zhuǎn)移提供條件［4］。李敏等［5］研究顯示，正常宮頸上皮無MMP-2表達(dá)，宮頸癌組織中MMP-2表達(dá)率為74.5%，其認(rèn)為MMP-2表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。劉嶸等［6］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者M(jìn)MP-9表達(dá)陽性率顯著高于CIN患者和正常宮頸組織。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著低于CIN組和ICC組，CIN組MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著低于ICC組。與上述研究結(jié)果相似，提示MMP-2和 MMP-9可能與宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。TIMPs是體內(nèi)MMP的天然抑制物，與MMPs結(jié)合特異性抑制其活性。南云澤等［7］研究顯示，TIMP-1在原位宮頸癌和宮頸浸潤癌表達(dá)率(54.3%和73.5%)顯著高于正常宮頸上皮(20.0%)。李芳等［8］研究顯示，TIMP-1和TIMP-2在宮頸鱗癌中的表達(dá)水平明顯低于慢性宮頸炎。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組TIMP-2和TIMP-1的表達(dá)水平顯著高于CIN組和ICC組，CIN組TIMP-2和TIMP-1的表達(dá)水平顯著高于ICC組。與上述研究結(jié)果相似，提示TIMP-2和TIMP-1可能與宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

尋找敏感而特異的生物學(xué)標(biāo)志物是非創(chuàng)性評估早期惡性腫瘤侵襲能力的研究方向。MMPs和TIMPs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性已在乳腺癌等腫瘤中得到證實，但其與宮頸癌患者的臨床病理因素關(guān)系尚不完全清楚。李嬋玉等［9］報道稱，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者M(jìn)MP-9表達(dá)陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且表達(dá)陽性率隨著腫瘤浸潤程度的增加而明顯增加。王德華等［10］研究顯示，MMP-2和TIMP-2在宮頸癌的陽性表達(dá)率與FIGO分期、組織分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著臨床分期升高、組織分級降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，MMP-2陽性表達(dá)率升高，而TIMP-2陽性表達(dá)率降低。張曉瑩等［11］研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9和TIMP-1在宮頸癌的表達(dá)率與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與病理類型和臨床分期無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ期、G3級、低分化、有脈管浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有間質(zhì)浸潤的ICC患者M(jìn)MP-2和MMP-9的表達(dá)水平分別顯著高于Ⅰ期、G1-G2級、中-高分化、無脈管浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無間質(zhì)浸潤的患者，而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平分別顯著低于Ⅰ期、G1-G2級、中-高分化、無脈管浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無間質(zhì)浸潤的患者。這提示 ICC患者M(jìn)MP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平與FIGO分期、組織學(xué)分級、分化程度、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度有關(guān)。因此，MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2可能在宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜述所述，MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-2、TIMP-1可能在宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其可作為評估宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的重要指標(biāo)。有關(guān)MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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