癲癇大鼠海馬線粒體融合分裂相關(guān)基因的表達(dá)變化

謝南昌，王 翠，張 倩，張宏偉，夏建華，連亞軍

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科 河南 鄭州 450052)

癲癇是臨床上最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究。以往研究認(rèn)為，癲癇主要是由興奮性氨基酸活動(dòng)過(guò)度引起的［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體功能障礙可導(dǎo)致癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作亦可引起線粒體損傷［2］。線粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生著頻繁的融合與分裂。在哺乳動(dòng)物中，線粒體融合蛋白1/2(mitofusin 1/2，Mfn1/2)和中國(guó)視神經(jīng)萎縮1(optic atrophy 1，OPA1)分別控制線粒體外膜與內(nèi)膜的融合;動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)和裂殖1同源物(fission 1，F(xiàn)is1)觸發(fā)線粒體的分裂［3］。一方面，融合使完整線粒體與損傷線粒體之間的內(nèi)容物混合，替換已經(jīng)損傷的物質(zhì)，如突變的線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，并恢復(fù)其功能。另一方面，線粒體分裂可以隔離線粒體中不可逆轉(zhuǎn)的損傷，使細(xì)胞內(nèi)功能紊亂的線粒體與具有呼吸活性的線粒體分開(kāi)，然后被自噬作用清除。且線粒體動(dòng)力學(xué)對(duì)于維持線粒體正常的形態(tài)、分布和功能十分重要［4］。

既然線粒體融合分裂影響著線粒體功能的多個(gè)方面，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作可使線粒體超微結(jié)構(gòu)受損，呼吸鏈活性下降，線粒體功能異常又導(dǎo)致神經(jīng)元對(duì)癇性損傷更敏感，形成惡性循環(huán)［5-6］。因此我們推測(cè)線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用，但國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用氯化鋰-匹魯卡品制作大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型動(dòng)態(tài)觀察了海馬Mfn2及Drp1 mRNA的表達(dá)變化，從線粒體融合分裂角度探討了癲癇神經(jīng)損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Light Cycler 2.0實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(Roche);匹魯卡品(Sigma);提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega);SYBR Green熒光染料試劑盒(Takara);其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 QT-PCR引物序列

1.2 動(dòng)物分組及制模 成年雄性Wistar大鼠(體質(zhì)量250～300 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，共48只。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，SE后2 h、8 h、24 h 組，每組 12 只，6 只用于免疫組化，6 只用于實(shí)時(shí)定量 PCR(real time quantitative PCR，QTPCR)。所有大鼠腹腔注射氯化鋰125 mg/kg，癲癇組大鼠20 h后給予腹腔注射匹魯卡品25 mg/kg，在匹魯卡品處理前30 min給予皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。對(duì)照組注射等量的生理鹽水代替匹魯卡品。按Racine標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作的程度。1級(jí):動(dòng)須、咀嚼等面部肌肉抽搐;2級(jí):節(jié)律性點(diǎn)頭;3級(jí):單側(cè)前肢陣攣、抽搐;4級(jí):站立伴雙前肢陣攣;5級(jí):4級(jí)+跌倒伴全身抽搐。SE判斷標(biāo)準(zhǔn):出現(xiàn)4級(jí)以上的發(fā)作并保持連續(xù)的運(yùn)動(dòng)性發(fā)作(如節(jié)律性點(diǎn)頭、面肌抽搐、肢體陣攣)至少30 min，其間不伴有正常的行為(如理毛)。癇性發(fā)作持續(xù)1 h時(shí)，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發(fā)作。如果有的小組中大鼠被排除，則即補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)量大鼠，以保證每組樣本量。

1.3 尼氏染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元損傷 各實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛(200 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，用4%多聚甲醛(pH 7.4)100 ml灌注固定，迅速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h，隨后經(jīng)包埋、快速冰凍后海馬部位做冠狀面連續(xù)切片，厚度為10 μm。按常規(guī)方法進(jìn)行尼氏染色，光鏡下觀察。

1.4 QT-PCR 各實(shí)驗(yàn)大鼠迅速斷頭取腦、分離海馬、液氮保存?zhèn)溆?。取液氮保存的海馬標(biāo)本150～200 mg，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取海馬組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系包括:RNase Free H2O 6.4 μl，上下游引物各 0.8 μl(10 μmol)，SYBR Green 10 μl，cDNA標(biāo)本2 μl。反應(yīng)體系加入毛細(xì)管后使用Light Cycler儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性10 s;循環(huán) 40次:95℃ 0 s，55℃(β-actin)/56℃(Mfn2)/53℃ (Drp1)10 s，72℃ 15 s，設(shè)置溫度改變速率均為20℃/s;95℃ 0 s，65℃ 30 s，95℃ 0.1℃/s(溫度改變速率);40℃ 30 s結(jié)束反應(yīng)。隨機(jī)選定某管PCR產(chǎn)物，稀釋為1～1×106梯度濃度，與樣本同時(shí)進(jìn)行PCR，測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Mfn2、Drp1和β-actin的拷貝數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算。數(shù)據(jù)分析:根據(jù)目的基因和內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算該樣本絕對(duì)定量的拷貝數(shù)，相除得到相對(duì)值進(jìn)行比較，即某樣本目的基因的拷貝數(shù)/某樣本內(nèi)參拷貝數(shù)，目的基因表達(dá)值以Mfn2(或Drp1)/β-actin拷貝數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 對(duì)照組和癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰后，均無(wú)明顯異常表現(xiàn)。達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作的大鼠歸為癲癇組，36只大鼠中有31只最后達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，呈現(xiàn)為SE，致癇成功率為86.11%;達(dá)到Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期為(38.6±16.9)min;大鼠 SE持續(xù)1 h后，癲癇終止發(fā)作，31只致癇成功的大鼠有3只24 h后行為活動(dòng)遲鈍，不能主動(dòng)進(jìn)食進(jìn)水，最終死亡。對(duì)照組大鼠注射生理鹽水后，未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

2.2 尼氏染色檢測(cè) 對(duì)照組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)可見(jiàn)大量致密的錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞，細(xì)胞排列整齊、形態(tài)完整，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。而SE組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)元胞體皺縮，胞漿深染，核固縮，胞漿尼氏小體減少，見(jiàn)表2。

表2 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)存活的錐體細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2，n=6)

2.3 QT-PCR檢測(cè)Mfn2、Drp1 mRNA含量的變化海馬組織Mfn2 mRNA在SE后2、8、24 h表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05);而Drp1 mRNA在 SE后2、8、24 h表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，其基本功能是通過(guò)氧化磷酸化以ATP的形式為細(xì)胞提供能量，腦內(nèi)ATP的消耗多用于神經(jīng)元的電活動(dòng)，故來(lái)自線粒體的充足能量供應(yīng)對(duì)維持神經(jīng)元的興奮性和生存具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作可損害線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致神經(jīng)元對(duì)癇性損傷更敏感，形成惡性循環(huán)［7-8］。那么癲癇發(fā)作是通過(guò)什么途徑引起線粒體結(jié)構(gòu)功能改變呢?

表3 Mfn2與Drp1 mRNA的相對(duì)表達(dá)值(目的基因/β-actin)(n=6)

線粒體在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生著頻繁的融合與分裂，融合與分裂的相對(duì)速度決定了線粒體的形態(tài)與數(shù)目。Mfn1/2廣泛表達(dá)分布于線粒體外膜，在線粒體融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠由于線粒體融合效率低下而導(dǎo)致線粒體片段化，線粒體移動(dòng)能力減弱，胚胎發(fā)育遲滯且胚胎死亡于妊娠中期［9］;Drp1又稱DNM1L蛋白，是調(diào)節(jié)線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白，其N端具有GTP酶結(jié)構(gòu)域，C端為GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，中間是Dynamin同源結(jié)構(gòu)域。Drp1主要定位于細(xì)胞漿，并以多聚體的形式存在。受線粒體外膜分子Fis1的招募而轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，并且富集于線粒體潛在的分裂位點(diǎn)形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，逐漸壓縮直至線粒體斷裂，產(chǎn)生兩個(gè)不同膜電位(ΔΨm)的線粒體碎片，其中低膜電位、具有融合缺陷的線粒體碎片通過(guò)自噬被清除。線粒體分裂后，Drp1重新回到胞漿，如此循環(huán)反復(fù)［10］。因此，線粒體分裂可以隔離線粒體中不可逆轉(zhuǎn)的損傷，使細(xì)胞內(nèi)功能紊亂的線粒體與具有呼吸活性的線粒體分開(kāi)，然后被自噬作用清除［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn):癲癇發(fā)作后Mfn2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，而Drp1 mRNA表達(dá)顯著升高，提示癲癇發(fā)作中存在線粒體融合分裂的失平衡。線粒體融合分裂平衡對(duì)于維持線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能有重要作用，其融合分裂平衡的紊亂將導(dǎo)致線粒體功能障礙，表現(xiàn)為ATP生成減少、氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多等，導(dǎo)致神經(jīng)元對(duì)癇性損傷更敏感，形成惡性循環(huán)［13］。因此，本研究提示線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用。

近幾年的大量研究提示，線粒體融合分裂與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［14］，凋亡早期線粒體網(wǎng)絡(luò)往往發(fā)生明顯的片段化，超表達(dá)介導(dǎo)線粒體分裂的分子Drp1或Fis1可以促進(jìn)線粒體分裂，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制Drp1或Fis1則可以抑制凋亡［15-16］。與此相一致的是，超表達(dá)介導(dǎo)線粒體融合的分子Mfn1/2或OPA1可以促進(jìn)線粒體融合，同時(shí)抑制凋亡，而抑制Mfn1/2或OPA1則可促進(jìn)凋亡［17-18］。這些都說(shuō)明線粒體融合分裂參與了凋亡過(guò)程。

綜上，癲癇發(fā)作可引起線粒體融合分裂基因Mfn2及Drp1在基因水平的表達(dá)改變，說(shuō)明線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇導(dǎo)致的線粒體結(jié)構(gòu)及功能紊亂中發(fā)揮重要作用。而“癲癇發(fā)作—線粒體融合分裂失平衡—線粒體損傷—加重癲癇發(fā)作”，這種惡性循環(huán)很好地解釋了癲癇與線粒體的關(guān)系，并提示我們探索是否可以通過(guò)調(diào)控線粒體融合分裂途徑阻止這種惡性進(jìn)程。因此，本研究為癲癇神經(jīng)損傷的防治提供一種新思路、新靶點(diǎn)。

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