松針纖維素降解菌的篩選及其混合發(fā)酵1)

范金霞 王 瑤 王宏燕 張 玨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150030)

我國大興安嶺地區(qū)松針資源豐富，品種較多，而松針是松樹類植物的主要副產(chǎn)物之一，具有再生速度快、四季均可采收、天然蓄積量大的特點，而且松林區(qū)發(fā)生火災(zāi)的危害極為嚴(yán)重。因此，積極研究開發(fā)并合理利用松針資源擁有重大意義。松針中纖維素類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)56.4%［1］。纖維素占陸地生態(tài)系統(tǒng)生物量的80%，是地球上數(shù)量最大的可再生資源，每年通過全球生物合成可再生性纖維素達(dá)1 000億t以上［2］。對于降解纖維素的菌種目前研究較多的是霉菌，尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型［3－4］，而對細(xì)菌的研究很少有報道。纖維素的生物降解研究表明［3］，單一微生物對纖維素的降解是很難完成的，或只能微弱進(jìn)行，必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同作用才能完成。

筆者從篩選降解松針纖維素的細(xì)菌菌株入手，篩選出酶活力性高而且降解纖維素快速的細(xì)菌。以松針粉末為主要碳源，結(jié)合菌株間的協(xié)同效應(yīng)，用纖維素降解菌的單獨(dú)及混合發(fā)酵培養(yǎng)來考查菌株對松針纖維素的分解力，以便為這些菌株的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集。從大興安嶺松林區(qū)采集腐殖土樣品，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原料。大興安嶺林區(qū)的落葉松和云杉的松針，烘干后粉碎，過100目篩。

培養(yǎng)基。無機(jī)鹽篩選培養(yǎng)基:KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.4 g、MgSO4·7 H2O 0.07 g、CaCl20.07 g、CuSO40.005 g、ZnCl20.001 g、Na2HPO40.5 g、C6H6O620g;蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS):蛋白胨0.5 g、松針 0.5 g、NaCl 0.5 g、CaCO30.3 g、酵母浸粉 0.1 g;細(xì)菌培養(yǎng)基(LB):蛋白胨 5.0 g、NaCl 5.0 g、酵母浸粉2.5g;羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基:KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.4 g、MgSO4· 7 H2O 0.07 g、CaCl20.07 g、CuSO40.005 g、ZnCl20.001 g、Na2HPO40.5 g、CMC(羧甲基纖維素)—Na 15.0 g。

1.2 方法

1.2.1 富集和純化

將從菌源地采樣得來的土壤樣品取5 g加入到100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，激活菌源土中的菌種，28℃，轉(zhuǎn)速151 r/min搖床培養(yǎng)，重復(fù)傳接V代。將第V代菌液稀釋成一系列不同的稀釋度，取 10－4、10－5、10－63種稀釋度，涂布于無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基平板，每個稀釋度涂布3個平板，28℃恒溫培養(yǎng)長出菌群后，反復(fù)劃線分離至長出單菌落，鏡檢確定菌體為較純的單菌落后，接種于保藏培養(yǎng)基上保存。

1.2.2 纖維素降解細(xì)菌的初篩

將得到的細(xì)菌菌株分別用剛果染色法對平板篩選，其中平板5次重復(fù)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，每個平板倒入20 mL剛果紅溶液(質(zhì)量濃度1 g·L－1)，染色 30 min 后，再用 1 mol·L－1氯化鈉溶液洗滌2～3次，測量透明圈和菌體的直徑。選取兩比值較大的菌落進(jìn)行下一步的單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 纖維素降解細(xì)菌的復(fù)篩

纖維素分解菌的單獨(dú)與混合發(fā)酵培養(yǎng):取100 mL的錐形瓶，裝入50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，并以體積比為5%的接種量接種，使其活菌數(shù)量達(dá)到1×109個/mL，于28℃、151 r/min的搖床震蕩培養(yǎng)，每隔24 h測量羧甲基纖維素酶活力。

粗酶液制備:取培養(yǎng)24h的發(fā)酵液10mL，在6 000 r·min－1條件下離心 10 min，所得上清液即為粗酶液。

羧甲基纖維素酶活力測定［5－6］:取 0.5%CMC—Na(溶于pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液)2.0 mL，加入粗酶液1.0 mL。于50℃恒溫水浴保持30 min。取出加入 DNS試劑3.0 mL，于沸水浴中放置 10 min。冷卻后于540 nm處測定其吸光度值，按DNS法測定還原糖。纖維素酶活力的國際單位為1 mL酶底物反應(yīng)液1 min內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg/L葡萄糖的還原糖量，即為1 U。

濾紙酶活力:將 0.03 g的濾紙浸入 1 mL 0.05 mol/L pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液中，后加入1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，在50℃的水浴條件下反應(yīng)60 min，加入3.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴中煮沸10 min，立即用冷水冷卻，于540 nm比色?？鄢敢汉偷孜锏目瞻缀?，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。

β－糖苷酶(β－Gase)活力:以 1.0 mL 0.5%的水楊素為底物(用0.05 mol/L pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液配制)，其余同CMC。

微晶纖維素酶活力:1 mL的1%微晶纖維素溶液(用0.05 mol/L pH5.0 的檸檬酸緩沖溶液配制)，加入1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，于50℃反應(yīng)120 min后，5 000 r/min離心10 min除去不溶物。然后取1.0 mL反應(yīng)上清液用DNS法測定還原糖，即取1 mL反應(yīng)上清液，加入 1 mL 0.05 mol/L pH=5.0 的醋酸—醋酸鈉緩沖液和3.0 mL DNS試劑，沸水浴中煮沸10 min，冷水冷卻后于540 nm比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集和純化

從菌源土中取8個平行，進(jìn)行36個小瓶的搖瓶篩選，其中1—10號瓶在28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，11—26號瓶以151 r/min 28℃搖床培養(yǎng)，27—36號瓶在37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每隔24 h測定纖維素酶活力。

經(jīng)實驗得知，測定1～6 d的纖維素酶活力，1—10號瓶總體在第3天的纖維素酶活力達(dá)到最高值，其中9號瓶的纖維素酶活力最高，為8.61 U;其次是3號瓶，達(dá)6.95 U。結(jié)果充分體現(xiàn)9號瓶與3號瓶中的纖維素降解菌群的酶活力相對較高，為篩選單獨(dú)菌種做理論基礎(chǔ)。而11—26號瓶在第4天時總體達(dá)到最高，其中第16號瓶中的微生物菌群的酶活力最高，達(dá)到20.10 U;11號與13號瓶的酶活力分別為1.18和 1.60 U，其酶活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 16號瓶，可能因為菌群之間相互抑制的作用，或該部分菌群不適應(yīng)這樣的發(fā)酵條件與發(fā)酵培養(yǎng)基。27—36號瓶中的菌群的纖維素酶活力經(jīng)實驗測得在第2天和第7天均出現(xiàn)峰值。

將篩選得出酶活力高的瓶進(jìn)行菌落分離與純化，根據(jù)剛果紅透明圈直徑大小與菌落直徑的比值和該酶活力成正比的原理，經(jīng)羧甲基纖維素瓊脂平板與濾紙培養(yǎng)基初篩，篩出19株細(xì)菌，分別為a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s，結(jié)果見表 1。可知，a、b、d、h、r、o 6 株細(xì)菌水解圈比較大，可為下一步單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

表1 培養(yǎng)24 h的不同細(xì)菌菌株的透明圈平均直徑

2.2 搖瓶篩選

2.2.1 菌株單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)

將初篩得到的5株纖維素降解細(xì)菌接入到以松針粉為主要碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24h測定羧甲基纖維素、微晶纖維素與濾紙酶活力。

由表2可知，篩選到的6株菌都具有一定的產(chǎn)纖維素酶能力，據(jù)文獻(xiàn)報道［7］羧甲基纖維素酶活力反映的是纖維素酶組分中內(nèi)切酶的活性。其中菌株h相對其他菌株酶活力最高，達(dá)21.06 U，其次是菌株 d，酶活力 19.35 U;菌株 r，酶活力 16.89 U;菌株b，酶活力 12.93 U。1～9 d，6 株菌均有兩個峰值，且第1個峰值高于第2個峰值。

表2 細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的羧甲基纖維素酶活力

實驗測得這幾株菌1～9 d的微晶纖維素酶活力均在第3天和第6天達(dá)到峰值，從表3可得出6株菌的纖維素酶活力都在90 U以上，其中菌株b最高，纖維素酶活力可達(dá)127.58 U;其次是菌株d，酶活力達(dá)121.80 U;再次是菌株h和r，酶活力分別為118.27 U和112.55 U。在達(dá)到第2個峰值后酶活力緩慢下降。

表3 細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的微晶纖維素酶活力

可以看出，6株濾紙的酶活力總體從第1天緩慢上升，然后在第3天均達(dá)到最高值，菌株r酶活力達(dá)66.46 U，菌株 d酶活力達(dá)62.77 U，菌株 h酶活力達(dá)52.93 U，菌株 b 酶活力 52.15 U，其中菌株 r的濾紙酶活力是6株菌中最高的。

表4 細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的濾紙酶活力

可以得出纖維素、微晶纖維素和濾紙酶活力均較高的 4 株菌，分別是菌株 b、d、h、r。

2.2.2 菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選出的4株菌b、d、h、r經(jīng)過24 h恒溫培養(yǎng)，分別以V(菌株)∶V(培養(yǎng)基)=1∶20的比例接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行2～4種混合培養(yǎng)，結(jié)果見表5—表8?？梢钥闯觯?xì)菌菌株混合培養(yǎng)在一定程度上會提高酶活力。

從表5可以看出混合菌組合中菌株bdh組合的酶活力最高，達(dá)31.38 U，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 b、d、h 3 株菌單獨(dú)培養(yǎng)的最高纖維素酶活力。菌株rd組合的酶活力相對較高，為29.19 U，僅僅低于組合bdh?？梢钥闯觯旌暇芯晗嗷ビ写龠M(jìn)作用，共同分泌纖維素酶達(dá)到高效分解纖維素的目的。

混合菌株組合的微晶纖維素酶活力見表6。1～9 d經(jīng)歷兩個峰值，第3天的峰值是最高的。菌株rd組合的微晶纖維素酶活力是最高的，為158.27 U，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他的組合;其次是菌株bdh組合，酶活力為150.41 U，其他組合基本都很平穩(wěn)，酶活力沒有太大的變化。

表6 混合菌株組合的微晶纖維素酶活力

混合菌組合的β－葡萄糖苷酶的酶活力見表7。菌株rd組合的β－葡萄糖苷酶酶活力最高，為30.37 U;而菌株 bdh 組合的酶活力為 26.04 U，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過別的組合菌株?？梢钥闯鼍阹h、bd、bh組合的β－葡萄糖苷酶的酶活力基本沒有太大的變化，這3組兩株菌的組合中存在著菌株之間的相互作用。而β－葡萄糖苷酶活力高的組合，在菌株混合之后相互促進(jìn)β－葡萄糖苷酶的分泌。纖維素的酶水解是由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶系統(tǒng)作用的結(jié)果［8］。

表7 混合菌組合的β－葡萄糖苷酶酶活力

混合菌組合的濾紙酶活力見表8，其中最高的兩個組合是菌株rd和菌株bdh組合，酶活力達(dá)66.89 U和72.13 U，菌株之間具有協(xié)同效應(yīng)。而rbdh組合酶活力僅僅達(dá)53.68 U，可見并不是把各種菌放在一起才會是效果更好，菌株之間存在相互抑制產(chǎn)酶的作用，導(dǎo)致4種菌混合在一起酶活力并沒有特別高。從第6天起，各種組合的酶活力緩慢下降。

表8 混合菌組合的濾紙酶活力

3 討論

羧甲基纖維素培養(yǎng)基應(yīng)用剛果紅染色法用于鑒別產(chǎn)纖維素酶的菌株，能初步判定菌株酶活力性的高低，本研究得到的4株細(xì)菌，24 h所產(chǎn)生的水解圈最大的為菌株d，但菌株d是哪種菌有待于進(jìn)一步研究。

綜合以往的研究方法，認(rèn)為單純通過單獨(dú)培養(yǎng)的方法獲得的纖維素分解單菌在功能發(fā)揮上受到很大限制。本研究篩選出的4株較好的纖維素降解細(xì)菌b、d、r、h單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)的酶活力相對沒有混合菌的酶活力高，而通過各種菌株組合，最后得出酶活力最高的是rd組合和bdh組合;綜合總體酶活力，bdh組合的效果最佳，其具體應(yīng)用有進(jìn)一步研究的價值與意義。

本研究采用松針為碳源，篩選產(chǎn)纖維素酶的菌株，由于不同的碳源對菌株產(chǎn)纖維素酶具有不同的誘導(dǎo)能力，而目前普遍認(rèn)為纖維素酶是一種具有不同底物特異性的多組分酶系。因此，對這些菌種的發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，才會更大程度上提高混合細(xì)菌降解松針的纖維素酶活力和羧甲基纖維素酶活力。

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