p40、TTF-I、p63、CK5/6在肺腺癌和肺鱗癌中的表達及其意義

焦立卓，陳涵斌，趙靈靈，王玲，林中民，陳霖，陳國榮，蔡國平

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015）

目前肺癌的發(fā)病率仍居高不下，嚴重威脅著人們的健康。肺腺癌有靶向治療，但如果肺鱗癌患者采用了肺腺癌靶向治療的藥物會導(dǎo)致嚴重出血。 新治療方法的療效取決于腫瘤的組織學(xué)特征，所以肺腺癌和肺鱗癌的鑒別，尤其是中-低分化肺腺癌與中-低分化肺鱗癌的鑒別具有很重要的臨床意義。目前應(yīng)用TTF-1、p63、CK5/6等免疫組織化學(xué)指標(biāo)來鑒別肺腺癌和肺鱗癌的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但其特異度和敏感度均不是很高。近來，國外研究顯示，ΔNp63（p40）似乎是一個更可靠的肺鱗癌的標(biāo)記物[1]。本實驗通過免疫組織化學(xué)法，檢測p40、TTF-1、p63、CK5/6在肺腺癌和肺鱗癌中表達的差異性，并分析4種蛋白表達與肺癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2011年1月-2012年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的肺腺癌標(biāo)本108例、肺鱗癌病理標(biāo)本66例。統(tǒng)計前經(jīng)本院2位病理科醫(yī)生重新讀片，核實診斷。肺癌病理標(biāo)本中男121例，女53例，年齡≥60歲的110例，＜60歲的64例。肺癌中高分化組18例，中分化組92例，低分化組64例。TNM分期[2]：I期與II期139例，III期35例。腫塊直徑≥3 cm的103例，＜3 cm的71例。無吸煙病史的83例，有吸煙史且＜30年的20例，≥30年的71例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，未轉(zhuǎn)移112例。

1.2 試劑和儀器 所用一抗包括兔抗人單克隆抗體p40，鼠抗人單克隆抗體p63，鼠抗人單克隆抗體CK5/6及鼠抗人單克隆抗體TTF-1；二抗PV-9000試劑盒，顯色DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司；p40購自Abcam（香港）有限公司，組織芯片制備儀TM-1購自北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制作：復(fù)習(xí)所有患者的常規(guī)HE切片，顯微鏡下觀察，每例選取3個（2處癌，1處癌旁）最具代表性病變的位置做定位標(biāo)記，在其對應(yīng)蠟塊上找出所標(biāo)記部位，采用組織芯片制備儀在預(yù)先制備好的空白受體蠟塊上打孔，在做好標(biāo)記的蠟塊上鉆取定位部位的組織柱，按設(shè)計方案植入受體蠟塊，形成一個微陣列。制作9×9組織芯片2個，9×8組織芯片5個，9×7組織芯片1個。同時收集乳腺癌、正常前列腺、皮膚、甲狀腺組織各一塊，脫水包埋，制作蠟塊，取組織柱放在微陣列旁作對照。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)4μm組織芯片切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，10%過氧化氫阻斷液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，高壓熱修復(fù)，修復(fù)液均為pH 8.0的EDTA液，自然冷卻，加一抗，4 ℃過夜，加二抗后37 ℃孵育30 min，DAB顯色。p40、p63、CK5/6、TTF-1分別用乳腺癌組織、前列腺組織、皮膚、甲狀腺組織做陽性對照，陰性對照均以PBS液代替一抗。

1.3.3 結(jié)果判定：p40、p63及TTF-1陽性細胞染色均位于細胞核，CK5/6陽性細胞染色位于細胞質(zhì)。由2位病理醫(yī)師對免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進行評估。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)切片中4個40倍物鏡視野中陽性細胞所占觀察同類細胞數(shù)的百分比判斷結(jié)果：陽性細胞0%～10%為“-”，11%～50%為“+”，51%～75%為“++”，75%～100%為“+++”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異性比較、蛋白表達與臨床病理指標(biāo)比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p40、p63、CK5/6、TTF-1蛋白在肺鱗癌中的表達 p40在66例肺鱗癌中的陽性表達率為93.9%（62/66），其中“+”12例、“++”27例、“+++”23例，見圖1。p63在肺鱗癌中的陽性表達率為86.4%（57/66），其中“+”14例、“++”25例、“+++”18例，見圖2。CK5/6在肺鱗癌中的陽性表達率為89.4%（59/66），其中“+”17例、“++”21例、“+++”21例，見圖3。TTF-1的陽性表達率為6.1%（4/62），其中“+”2例、“++”1例、“+++”1例，見圖4。

2.2 TTF-1、p40、p63、CK5/6蛋白在肺腺癌中的表達 TTF-1在108例肺腺癌中的陽性表達率為95.4%（103/108），其中“+”22例、“++”40例、“+++”41例（見圖5）。p40的陽性表達率為3.7%（4/108），“+”4例，見圖6。p63陽性表達率為22.2%（24/108），其中“+”20例、“++”4例。CK5/6的陽性表達率為24.1%（26/108），其中“+”18例、“++”8例。

2.3 p40在肺鱗癌診斷中的優(yōu)勢 p40、p63、CK5/6在肺鱗癌中的特異度分別是96.3%、77.8%、75.9%，三者的特異度經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），p40對肺鱗癌的特異度高于p63、CK5/6（P＜0.05），p63與CK5/6對肺鱗癌的特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；三者對肺鱗癌的靈敏度分別是93.9%、86.4%、89.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=3.526，P=0.172），見表1。

圖1 p40在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖4 TTF-1在肺鱗癌中的強陽性表達（×400）

圖2 p63在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖5 TTF-1在肺腺癌中呈強陽性表達（×400）

圖3 CK5/6在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖6 p40在肺腺癌中的弱陽性表達（×400）

表1 p40、p63、CK5/6、TTF-1蛋白在肺癌中的表達

2.4 p40、p63、CK5/6、TTF-1與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性 p40、p63、TTF-1與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關(guān)（均P＜0.05），與年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)（均P＞0.05）；CK5/6與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史及分化程度有關(guān)（均P＜0.05），與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)（均P＞0.05）。具體見表2。

2.5 p40、p63、CK5/6在不同分化程度肺鱗癌中的表達 在低分化肺鱗癌中p40的陽性表達率（為89.3%）高于p63（為78.6%）和CK5/6（為75.0%），在高、中分化肺鱗癌中三者的陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

目前對于分化程度較好的肺腺癌和肺鱗癌，兩者鑒別一般不存在困難，但是對于低分化肺腺癌和肺鱗癌的鑒別仍具有挑戰(zhàn)性，需要進行免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記區(qū)分。組織芯片技術(shù)適于研究腫瘤群體，能夠很好地反映免疫組織化學(xué)指標(biāo)與腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

3.1 p40、p63、CK5/6、TTF-1在肺腺癌和肺鱗癌中的表達情況 文獻報道TTF-1在肺腺癌的陽性表達率為27%～100%[3-4]。國內(nèi)王紅梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)TTF-1在肺腺癌中的陽性表達率為84.6%，在肺鱗癌中的陽性表達率為5%。TTF-1還可以在肺小細胞癌及腦組織中表達[6]，陽性表達率各研究報道不一。本研究中TTF-1在108例肺腺癌中的陽性表達率為95.4%（103/108），在肺鱗癌中的陽性表達率為6.1%（4/62），肺腺癌中TTF-1的陽性表達率高于文獻報道，可能與本研究采用的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)本均為手術(shù)切除標(biāo)本有關(guān)。肺鱗癌中TTF-1的陽性表達率與文獻報道較一致。

p63基因編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：一類是與p53相似的酸性N端反式激活區(qū)的全長p63（TAp63），其功能與p53類似，能反式激活p53靶基因的轉(zhuǎn)錄并且可以誘導(dǎo)細胞凋亡；另一類為缺乏酸性N端反式激活區(qū)的截短p63（△Np63），其喪失了反式激活p53靶基因及誘導(dǎo)細胞周期停滯、細胞凋亡的功能[7]。Nonaka等[8]的研究中檢測了p63、p40及TTF-1在150例肺腺癌和50例肺鱗癌中的表達，結(jié)果顯示，p40選擇性地表達在鱗癌，p63不僅限于鱗癌，在腺癌中的陽性表達率約15%，其表達可以是彌漫的，p63在除外黏液型腺癌的所有亞型腺癌中均表達。p40在所有肺腺癌呈陰性。p63陽性的低分化肺腺癌可能被錯誤地診斷為肺鱗癌。力超等[9]檢測了p40、p63、TTF-1在107例肺鱗癌和119例肺腺癌中的表達，結(jié)果顯示p40、p63的靈敏度、特異度分別為93.5%、97.5%和94.4%、74%。Bishop等[1]檢測了p40、p63在81例肺鱗癌、237例肺腺癌和152例大細胞淋巴瘤中的表達，p40的靈敏度為100%，特異性為98%；p63的靈敏度為100%，特異性為60%。本實驗結(jié)果顯示p40、p63、CK5/6在肺鱗癌中的靈敏度分別是93.9%、86.4%、89.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；特異度分別是96.3%、77.8%、75.9%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。p40在肺鱗癌中有50例呈“++、+++”（陽性細胞比例為51%～100%），12例呈“+”（陽性細胞比例為11%～50%），強陽性表達率為80.6%；p63強陽性表達率為75.4%（43/57）；CK5/6強陽性表達率71.2%（42/59）。在肺腺癌中p40陽性表達率為3.7（4/108），4例均呈“+”（陽性細胞比例為11%～50%）；p63陽性表達率為22.2%（24/108）；CK5/6陽性表達率為24.1%。上述實驗結(jié)果與文獻報道的基本一致。證實p40與p63、CK5/6相比，是一個更可靠的肺鱗癌標(biāo)記。

表2 p40、p63、CK5/6、TTF-1的表達與肺癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

表3 p40、p63、CK5/6的表達與鱗癌分化程度的關(guān)系 n（%）

3.2 p40、p63、CK5/6、TTF-1與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性 有文獻報道TTF-1蛋白在女性、不吸煙、高分化及無癥狀者中升高明顯，主要表達于肺腺癌。p63蛋白陽性多見于男性、有吸煙史者，其表達隨著肺鱗癌的分化程度增加而增加，與臨床分期呈負相關(guān)。logistic多因素分析顯示，患者有無吸煙史及病理類型為影響TTF-1、p63表達的因素[10]。張瑞萍等[11]指出TTF-1的陽性表達率與肺癌組織類型密切相關(guān)，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無關(guān)。本研究中p40、p63、TTF-1的表達與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關(guān)，與年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)；CK5/6除了與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關(guān)外，還與分化程度有相關(guān)性，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)。結(jié)果顯示肺癌患者的一些臨床病理指標(biāo)與免疫組織化學(xué)指標(biāo)表達的陽性率之間存在相關(guān)性。

3.3 p40、p63、CK5/6在不同分化程度肺鱗癌中的表達 在低分化肺鱗癌中p40的陽性表達率（為89.3%）高于p63（為78.6%）和CK5/6（為82.1%），本實驗中由于收集的高分化鱗癌例數(shù)過少，尚不能說明各指標(biāo)在高分化鱗癌中的陽性表達率是否存在差異，但在實際工作中，高分化肺鱗癌較易通過常規(guī)病理形態(tài)學(xué)得以確診，而p40對低分化肺鱗癌的鑒別是優(yōu)于p63、CK5/6的。

綜上所述，p40在肺鱗癌的鑒別中有較高的特異度，其對低分化肺鱗癌的鑒別也存在優(yōu)勢，對臨床工作中難以鑒別的肺鱗癌和肺腺癌具有較高的實用價值。但本實驗只是初步探討了p40、p63、CK5/6、TTF-1對肺鱗癌和肺腺癌的鑒別等應(yīng)用價值及其表達與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，由于肺腺癌和肺鱗癌的明確鑒別具有重要的臨床意義，所以我們需要進一步探索和尋找更好的免疫組織化學(xué)指標(biāo)，并明確各免疫組織化學(xué)指標(biāo)與患者臨床病理指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系。

[1]Bishop JA, Teruya-Feldstein J, Westra WH, et al. p40(ΔNp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma[J]. Mod Pathol, 2012, 25(3): 405-415.

[2]葉波, 楊龍海, 劉向陽. 最新國際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版)修訂稿解讀[J]. 中國醫(yī)刊, 2008, 43(1): 21-23.

[3]Wu M, Wang B, Gil J, et al. P63 and TTF-1 immunostaining. A useful marker panel for distinguishing small cell carcinoma of lung[J]. Am J Clin Pathol, 2003, 119(5): 696-702.

[4]Marson VJ, Mazieres J. Expression of TTF-1 and cytokeratins in primary and secondry epithelial lung tumors: correlation with histological type and grade[J]. Histopathology,2004, 45(2): 125-134.

[5]王紅梅, 周曉鴿. TTF-1在肺癌診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價值[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2005, 12(6): 441-443 .

[6]Kargi A, Gurel D, Tuna B. The diagnostic value of TTF-1,CK 5/6, and p63 immunostaining in classification of lung carcinomas[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2007,15(4): 415-420.

[7]周春輝, 王華新, 李曉楠, 等. 肺癌中p63與p53、E-cadherin、Ki-67表達的比較[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2004,20(4): 432-435.

[8]Nonaka D. A study of ΔNp63 expression in lung non-small cell carcinomas[J]. Am J Surg Pathol, 2012, 36(6): 895-899.

[9]力超, 韓維靜, 何同梅, 等.p40(ΔNp63)在肺腺癌和鱗癌鑒別診斷中的價值[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2013, 29(8):855-858.

[10]張鵬, 韓一平, 黃玲, 等. TTF-1和p63在NSCLC組織中的表達及臨床意義[J]. 中國肺癌雜志, 2009, 12(9): 995-999.

[11]張瑞萍, 高志安, 崔志, 等. Napsin A與TTF-1在肺癌中的表達及意義[J]. 中外醫(yī)療, 2012, 31(26): 10-12.