咳喘寧霧化吸入對哮喘大鼠肺泡灌洗液白介素-5與嗜酸性粒細胞的影響

吳文娟，董曉斐*，李嬌艷，陳春輝，周婭薇

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

咳喘寧霧化吸入對哮喘大鼠肺泡灌洗液白介素-5與嗜酸性粒細胞的影響

吳文娟，董曉斐*，李嬌艷，陳春輝，周婭薇

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察咳喘寧霧化吸入對肺泡灌洗液（BALF）中白介素-5（IL-5）表達、嗜酸性粒細胞（EOS）計數(shù)的影響，探討其對哮喘大鼠氣道炎癥的作用機制。方法 將SD雄性幼齡大鼠40只，隨機分為正常組、哮喘模型組、咳喘寧干預組、布地奈德干預組，每組10只。經(jīng)雞卵蛋白（OVA）致敏后，給予OVA霧化吸入誘發(fā)哮喘發(fā)作，制作哮喘模型。咳喘寧干預組與布地奈德干預組分別給予咳喘寧口服液1.7 g/kg，布地奈德0.1 mg/kg，正常組與哮喘模型組予以等量生理鹽水霧化。霧化7 d后，處死大鼠，檢測大鼠BALF中IL-5水平和EOS計數(shù)。結(jié)果 咳喘寧干預組大鼠BALF中的IL-5與EOS明顯低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與布地奈德干預組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 咳喘寧通過霧化吸入能降低哮喘大鼠BALF的IL-5水平及EOS計數(shù)，從而改善哮喘大鼠氣道炎癥狀態(tài)。

哮喘；咳喘寧；霧化吸入；白介素-5；嗜酸性粒細胞；大鼠

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是氣道的炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]，是兒童時期最常見的呼吸道慢性疾病，其急性發(fā)作，是嚴重威脅患者生命的臨床急癥之一。氣道非特異性炎癥是哮喘基本病理特點。吸入糖皮質(zhì)激素已公認為有效的抗炎手段，但因為激素具有全身副作用而不能長期使用。目前中藥霧化吸入引入哮喘治療，多項臨床研究證實，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上結(jié)合中藥霧化，比單純用西藥治療效果好[2-3]?？却瓕幾鳛槲以鹤灾扑?，臨床研究及動物實驗均表明它對哮喘有較好療效。為進一步研究其防治哮喘的機制，本文采用霧化給藥途徑，探討咳喘寧霧化吸入對哮喘大鼠氣道炎癥的影響，為哮喘急性發(fā)作治療提供一定實驗依據(jù)?，F(xiàn)將方法及結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號:SCXK（湘）2011-0003，28～42 d，體質(zhì)量（120±20）g，正常飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2 藥物 咳喘寧由炙麻黃、苦杏仁、桃仁、大青葉、黃芪、生石膏、細茶葉和甘草等中藥組成，湖南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院制劑室提供，批號: 20120510，采用自動煎藥機煎后密封包裝，每包100 mL，每毫升含生藥1 g。

1.1.3 試劑與儀器 吸入用布地奈德混懸液（Astra Zeneca Pty Ltd公司生產(chǎn)，規(guī)格:2 mL/支，批號: X20010423）；白介素（IL-5）、酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒 （武漢博士德公司生產(chǎn)，批號:20121013）；402AI醫(yī)用超聲霧化吸入器 （上海四菱醫(yī)用恒溫設(shè)備有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 取40只雄性大鼠，按隨機排表分為4組，每組10只，取1組作為正常組，其余大鼠均參照呂國平等[4]方法復制為哮喘模型。造模方法:分別于第1和第8天，分別向腹腔注射共1 mL含1 mg雞卵蛋白（OVA）和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原致敏，第9天至21天霧化吸入OVA，每日1次，每次30 min，連續(xù)2周，以出現(xiàn)明顯點頭樣呼吸，腹肌抽搐，甚至站立不穩(wěn)而撲倒時即為哮喘急性發(fā)作，提示造模成功[4]。將造模成功大鼠分為3組，每組10只，分別為哮喘模型組、咳喘寧干預組、布地奈德干預組。正常組大鼠于第1天和第8天向腹腔注射1 mL生理鹽水，第9～21天霧化吸入等量生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 造模成功后當天進行給藥，每天霧化2次，每次20 min，連續(xù)霧化7 d。按照《藥理學實驗方法》[5]，人與動物等效劑量換算方法，各組藥物用量如下:咳喘寧干預組以咳喘寧1.7 g/（kg·次），溶于20 mL生理鹽水中霧化；布地奈德干預組以0.1 mg/（kg·次），溶于20 mL生理鹽水中霧化，正常對照組與哮喘模型組以等體積生理鹽水霧化。

1.3 標本采集與檢測

1.3.1 肺泡灌洗液（BALF）IL-5水平檢測 末次霧化后，以10%水合氯醛向腹腔注射麻醉大鼠后，股動脈放血處死。打開胸腔暴露肺臟，結(jié)扎右側(cè)肺門，分離出頸部氣管，并做氣管切開插管固定。用生理鹽水2 mL注入肺內(nèi)，停留30 S后回抽灌洗液。重復上述操作3次，記錄回收液體量。1 000 r/min離心15 min，離心后取上清液0.5 mL，置于-70℃冰箱內(nèi)，用于IL-5檢測。

1.3.2 采用ELISA法檢測IL-5嗜酸性粒細胞（EOS）的計數(shù) 取上述步驟中獲得BALF離心細胞沉淀，采用血細胞分析儀計算大鼠BALF的EOS計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 咳喘寧對大鼠BALF中IL-5的影響

哮喘模型組BALF中IL-5高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示造模成功?？却瓕幐深A組和布地奈德干預組的BALF中IL-5均低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；布地奈德干預組BALF中IL-5低于咳喘寧干預組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 咳喘寧對大鼠BALF中EOS的影響

正常組BALF未檢測到 EOS。哮喘模型組BALE中EOS高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）?？却瓕幐深A組和布地奈德干預組的BALF中EOS均低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義 （P< 0.05）；布地奈德干預組與咳喘寧干預組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 咳喘寧霧化吸入對哮喘大鼠BALF中IL-5水平與EOS計數(shù)的影響 （n=10，±s）

表1 咳喘寧霧化吸入對哮喘大鼠BALF中IL-5水平與EOS計數(shù)的影響 （n=10，±s）

注:與哮喘模型組比較*P<0.05；與咳喘寧干預組相比▲P>0.05。

組別正常組哮喘模型組咳喘寧干預組布地奈德干預組劑量（g/kg）——1.7 0.000 1 IL-5(IU/L) 5.62±0.42* 8.59±0.33 7.47±0.45* 6.95±0.20*▲EOS(×108/L) 0 1.07±0.22 0.29±0.13* 0.34±0.10*▲

3 討論

哮喘是多種細胞因子和多種細胞介導的呼吸道慢性炎癥。多種細胞浸潤及細胞因子的異常分泌是哮喘發(fā)病機制。IL-5等細胞因子的異常增高在哮喘多種病理改變中起著不可替代的作用，尤其在協(xié)調(diào)和促進以EOS為基礎(chǔ)的炎性過程中起著關(guān)鍵作用[6]。哮喘患者支氣管肺組織內(nèi)大量炎性細胞浸潤，以EOS增多最為顯著。臨床研究表明哮喘急性發(fā)作時，氣道EOS可作為急性發(fā)作期診斷依據(jù)[7]。IL-5是一種EOS分化因子，被認為是EOS活化、成熟、趨化、存活和募集至氣道不可缺少因子[8]。研究證實IL-5可使氣道變態(tài)反應性炎癥中EOS數(shù)目增多和活性增強，誘導EOS的前體生長和分化，對成熟EOS也有趨化和激活作用。而抗IL-5治療可抑制EOS在氣道的浸潤，從而減輕氣道炎癥[9]。

中醫(yī)學認為，哮喘為內(nèi)有痰飲留伏、外因邪氣引動而誘發(fā)，病位在肺?？却瓕幱晌寤徒叵诜海ㄎ以鹤灾扑帲┒交枚?。方中麻黃、苦杏仁宣降肺氣，通暢氣道，從而降低氣道反應性，共為本方君藥；黃芪扶正祛邪，石膏清泄肺熱，大青葉清熱抗炎，具有抗病毒，共為臣藥；桃仁活血化瘀以改善微循環(huán)、改善炎癥病灶，細茶葉清神化痰，甘草鎮(zhèn)咳平喘，具有抗炎、抗變態(tài)反應作用，共為本方佐使。諸藥合用，共奏清熱解毒、扶正化痰、宣暢郁閉之肺衛(wèi)氣機、清除哮喘激發(fā)因素、降低氣道反應性等功效，能有效地治療哮喘[10]。動物試驗中發(fā)現(xiàn)咳喘寧能降低肺組織中EOS浸潤，降低氣道反應性和平滑肌收縮程度，緩解支氣管痙攣[11]。本實驗在此基礎(chǔ)上，從IL-5和EOS探討咳喘寧防治哮喘機制，主要通過霧化給藥來治療哮喘。霧化吸入能使藥物直達病所，同時通過“肺朝百脈”而輸布全身，進而改善機體血液循環(huán)，消除支氣管黏膜水腫，解除氣道痙攣，使癥狀減輕，具有作用直接、起效快、用藥量少，全身不良反應小的優(yōu)點。王妍煒等通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)中藥霧化吸入治療能有效地控制小兒哮喘發(fā)作期的癥狀和體征，改善通氣功能，并縮短療程[2]。目前中藥霧化已逐步引入哮喘治療。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過咳喘寧霧化治療哮喘大鼠BALF中IL-5與EOS水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義，與布地奈德干預組比較，差異無統(tǒng)計學意義。在既往研究基礎(chǔ)上，咳喘寧霧化能降低BALF中IL-5和EOS水平，改善哮喘大鼠氣道炎癥，為中藥霧化防治哮喘提供一定的實驗依據(jù)。

[1]林燕萍.支氣管哮喘防治指南[G].西安第四屆中國中西醫(yī)結(jié)合學會變態(tài)反應學術(shù)大會論文匯編，2009:94-97.

[2]王妍煒.中藥霧化吸入治療小兒哮喘發(fā)作療效觀察[J].中國中醫(yī)急癥，2006，15（8）:832-839.

[3]張少華.中藥霧化吸入治療哮喘急性發(fā)作28例療效觀察[J].四川中醫(yī)，2004，22（5）:41-43.

[4]呂國平，崔德健，郭英江，等.介紹一種建立大鼠哮喘模型的實驗方法[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，1995（6）:377-378.

[5]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理學實驗方法[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1991:178-179.

[6]楊 海，楊小蘭，陳遠東，等.檢測誘導痰嗜酸性粒細胞在哮喘病情評估的應用[J].實用醫(yī)學雜志，2012，28（6）:993-994.

[7]Motojima S，F(xiàn)rigas E，Loegering DA，et al.[J]Am Rev Repir Dis，1989，13(9):801-805.

[8]Takastu K，Nakajima H.IL-5 and eosinophilia[J].Curr Opin Immuno，2008，20(3):288-294.

[9]Shardonfsky FR，Venzor J 3rd，Barrios R，et al.Therapeutic efficacy of an anti-IL-5 monoclnal antibody delivered into the repiratiry tract in a murine model asthma[J].JAllergy Clin Immunol，1999，104(1):215-221.

[10]王孟清，羅銀河，陳錫軍，等.咳喘寧治療病毒誘發(fā)小兒哮喘的臨床研究[J].新中醫(yī)，2007，39（4）:16-17.

[11]董曉斐，羅銀河，王孟清，等.咳喘寧對哮喘豚鼠EOS的調(diào)節(jié)作用[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2008，28（5）:36-37.

（本文編輯 徐愛良）

Effects of Kechuanning by atomization inhalation on IL-5 expression and EOS in Bronchoalveolar lavage fluid of asthma SD rats

WU Wenjuan,DONG Xiaofei,LI Jiaoyan,CHEN Chunhui,ZHOU Yawei
(First Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effects of Kechuanning(KCN)by atomization inhalation on the expression of interleukin 5(IL-5)and eosinophil(EOS)count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)in asthmatic SD rats,and explore the mechanism of KCN on airway inflammation of asthmatic SD rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into normal group, asthmatic group,KCN group and budesonide group with 10 rats in each group.The asthmatic model was established by sensitizing and challenging SD rats with aerosolized ovalbumin (OVA).KCN group rats were treated with 1.7 g/kg KCN by atomization inhalation, budesonide group rats were treated with 0.1 mg/kg budesonide,normal group and asthmatic group rats were treated with equal amount of saline.After treatment for a week,the rats were killed and theIL-5inBALF wasmeasuredby enzymelinkedimmunosorbentassay,EOS countwas also carried out.Results The IL-5 and EOS of BALF in the KCN group rats were markedly lower than those in asthmatic group(P<0.05).The differences between the KCN group and the budesonide group were not marked (P>0.05). Conclusion KCN by atomizationinhalation can decrease the levelofIL-5 and EOS in BALF,and then improve airway inflammation of asthmatic rats.

asthma;Kechuanning;atomization inhalation;interleukin 5;eosinophil;rat

R272，R725.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.005.019.03

2013－10－08

湖南省科技廳科研資助項目（2013SK3087）；研究生創(chuàng)新課題（CX2012B346）；湖南省教育廳科研資助項目（11B094）。

吳文娟，女，在讀碩士研究生，研究方向:小兒肺系疾病與新生兒疾病。

*董曉斐，女，副主任醫(yī)師，E-mail:dxf3204@163.com。