正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取大花紅景天多糖工藝

周凌云，周 建，阮文懿，王朝清，孫 玉

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.無為縣人民醫(yī)院，安徽 無為238300)

大花紅景天Rhodiolacrenulata(HK.f.et Thoms.) H.Ohba系景天科紅景天屬多年生藥食兩用草本植物.研究表明，紅景天具有強(qiáng)身、抗缺氧、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗微波輻射及興奮大腦和脊髓的作用[1-2].國(guó)內(nèi)外對(duì)于大花紅景天多糖提取方法通常采用熱水提取[3]，需要較長(zhǎng)的時(shí)間和較多的能耗.隨著科學(xué)的發(fā)展，更多的提取手段被用在植物化學(xué)成分提取方面.對(duì)于本屬其它植物的多糖成分利用新的手段進(jìn)行提取也有報(bào)道[4-5]，但對(duì)于大花紅景天利用超聲波輔助提取優(yōu)化工藝方法未見報(bào)道.本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)于大花紅景天的微波輔助提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，比較了超聲波提取方法和傳統(tǒng)熱水提取方法在多糖得率上的差異，并考察了提取工藝對(duì)多糖破壞程度.

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器:KH-400DB型超聲數(shù)控清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；FA-2400型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；SHZ-III循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(heidolph laborota 4003)；DZF-6050 型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司).

材料:大花紅景天根莖(青海西寧唐古風(fēng)商貿(mào)有限公司提供，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院包淑云副教授鑒定為大花紅景天，留樣于藥物化學(xué)教研室)；其余試劑均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純.

1.2 方法

(1)紅景天多糖含量測(cè)定方法的建立.參照黃家錕等人測(cè)定紅景天多糖的方法，同法操作，以吸光度A對(duì)葡萄糖濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=0.0168C+0.0342(r=0.9998).實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖在5～60ug/mL范圍呈良好的線性關(guān)系.

(2)加樣回收試驗(yàn).分別吸取葡萄糖對(duì)照品溶液6份，置已知含量的供試品溶液中，按1.2(1)條件測(cè)定.測(cè)得平均回收率為99.39%，RSD為0.81%，說明用苯酚-硫酸法測(cè)定大花紅景天中多糖含量的準(zhǔn)確度較高.

(3)提取工藝對(duì)多糖破壞程度方法的建立.①參照3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS比色法)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0165C+0.0459(r=0.9997).通過酸水解多糖提取物，利用總糖質(zhì)量濃度減去游離單糖質(zhì)量濃度，計(jì)算出多糖得率，可判斷提取工藝對(duì)多糖的破壞程度.②根據(jù)單糖及多糖在80%乙醇溶解度的差異，將粗多糖用優(yōu)化后的方法進(jìn)行提取，提取物用80%乙醇回流1h，濾渣干燥.在相同取樣量和相同分析條件下，比較粗多糖和處理后多糖的質(zhì)量濃度，判斷提取工藝對(duì)多糖的破壞程度.

2 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果

2.1 紅景天粉末的預(yù)處理

稱取大花紅景天粉100g，置500mL圓底燒瓶中，將此燒瓶放入加熱回流提取裝置中，依此用500mL石油醚回流提取2次，濾液除去，80%的乙醇回流提取2次，每次1h，最后將殘?jiān)湃?0℃的真空干燥箱中烘干，備用.

2.2 傳統(tǒng)水提取工藝

(1)水提取實(shí)驗(yàn).根據(jù)黃家錕、宋學(xué)偉等人的正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化大花紅景天多糖提取工藝的結(jié)論，取2g大花紅景天粉末，以料液比1:12，溫度80℃，提取時(shí)間為2h處理.將所得提取液濃縮干燥后，取樣，用適量水溶解，定容到100mL, 利用苯酚-硫酸法測(cè)量吸光度值為0.1575，得多糖質(zhì)量濃度為7.34ug/mL，多糖得率為10.29%.

(2)水提取工藝對(duì)多糖破壞程度實(shí)驗(yàn).將2.2(1)剩余粗多糖分為A,B兩組.A組利用DNS比色法，按1.2(3)①操作，得到多糖得率為10.13%，多糖得率與略低于2.2(1)中的10.29%，兩者間的多糖得率差值Δ%=0.16%.B組利用80%乙醇回流，按1.2(3)②操作，測(cè)得吸光度值為0.1420，得多糖質(zhì)量濃度為6.42ug/mL.多糖質(zhì)量濃度低于2.2(1)中的7.34ug/mL，處理前后的質(zhì)量濃度差值ΔC=0.92ug/mL.由A,B兩組數(shù)據(jù)，我們可知在水提過程中，多糖結(jié)構(gòu)遭到了一定程度的破壞.

2.3 超聲波法提取工藝優(yōu)化

(1)單因素實(shí)驗(yàn).①超聲提取的溫度考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末6份，固定條件在料液比為1:20，時(shí)間為30min，提取液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0%，分別控制溫度在50、60、65、70、75、80℃各提取3次.考察溫度對(duì)超聲提取的影響，結(jié)果如圖1所示.可以看出，溫度的高低直接影響多糖的得率.當(dāng)溫度為65℃時(shí)，多糖得率最高，達(dá)到13.44%.因此，最佳超聲溫度為65℃.②超聲提取的時(shí)間考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在溫度65℃，料液比為1:20，提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0%，分別控制時(shí)間在15、20、30、40、50、60min 各提取3次.考察時(shí)間對(duì)超聲提取的影響，結(jié)果如圖2所示.可以看出隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率略有提升后便開始下降.這可能是多糖引起的熱量積聚或機(jī)械剪切作用導(dǎo)致多糖架構(gòu)變化而損失.當(dāng)超聲時(shí)間為20min，多糖得率最高，達(dá)到14.77%.因此，最佳超聲時(shí)間為20min.③提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)的考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在料液比為1:20，時(shí)間為20min，溫度為65℃，分別控制提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0%、5%、10%、15%、20%、25%各提取3次，考察提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲提取的影響.結(jié)果如圖3所示.

圖1 溫度對(duì)大花紅景天多糖提取的影響

圖2 時(shí)間對(duì)大花紅景天多糖提取的影響

圖3 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)大花紅景天多糖提取的影響

圖4 料液比對(duì)大花紅景天多糖提取的影響

3種大孔吸附樹脂 X-5，S-8，D101 的吸附與解吸實(shí)驗(yàn)表明，洗脫劑中適當(dāng)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)時(shí)，洗脫部分的吸光度和收率均較好，說明一定比例乙醇的存在可能提高多糖的溶解解吸能力.所以，將乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖溶解的影響作為單因素進(jìn)行探討.從圖3可以看出，隨乙醇的體積分?jǐn)?shù)的增加，多糖得率先上升后下降，5%時(shí)，多糖得率最高，達(dá)到12.50%.因此，最佳乙醇的體積分?jǐn)?shù)為5%.④超聲提取的料液比考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在時(shí)間為15min，溫度為65℃，提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為5%，分別控制料液比為1:8，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30各提取3次，考察料液比對(duì)超聲提取的影響，結(jié)果如圖4.可以看出，液料比在1:8，1:25，1:30時(shí)，多糖得率的變化不大，但明顯低于1:10，1:15，1:20.這是因?yàn)榱弦罕忍?，短時(shí)間內(nèi)多糖的浸提就達(dá)到平衡，不利于多糖的進(jìn)一步溶出.而若料液比太高，濃縮時(shí)間過長(zhǎng)，容易造成多糖的破壞.而當(dāng)料液比為1:15時(shí)，多糖得率高達(dá)20.31%.因此，料液比宜采用1:15.

(2)正交試驗(yàn).選取各個(gè)因素中3個(gè)最佳水平安排正交實(shí)驗(yàn)，得到超聲提取紅景天多糖的最佳工藝條件為A1B2C2D2，即提取溫度為65℃，料液比為1:15，提取時(shí)間為20min，提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0%.各個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響順序?yàn)椋毫弦罕?乙醇的體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間.如表1和表2所示.

表1 單因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

(3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).取已預(yù)處理過的大花紅景天粉3份，均按照A3B1C1D2工藝條件進(jìn)行提取，按照1.2(1)中的①項(xiàng)下公式計(jì)算多糖得率分別為 15.54%，15.50%，15.52%(RSD=0.13%)，3者均高于正交實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的任一條件下的評(píng)分，故驗(yàn)證該工藝即為大花紅景天超聲提取的最佳工藝.

2.4 提取工藝對(duì)多糖破壞程度實(shí)驗(yàn)

(1)3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS比色法).將大花紅景天粉末最佳工藝提取的粗多糖分為兩組，一組用適量水溶解后酸水解作為總糖溶液，一組用適量水溶解后做單糖溶液，分別于DNS試劑反應(yīng)后測(cè)吸光度值，計(jì)算出多糖得率為15.35%.本實(shí)驗(yàn)最佳正交條件的得率為15.48%，兩者間多糖得率的差值Δ%=0.13%.此差值與2.2(2)中的A組的差值Δ%=0.16%相比，二者之間差別很小.

(2)80%乙醇回流提取.取等量大花紅景天粉末，按最佳正交條件處理，將所得粗多糖取樣按1.2(1)測(cè)定吸光度值為0.7217，得多糖質(zhì)量濃度為40.92ug/mL.再將剩余粗多糖用80%乙醇80℃回流1h，過濾得濾渣，再次干燥后測(cè)吸光度值為0.7122，得多糖質(zhì)量濃度為40.36ug/mL.處理前后多糖質(zhì)量濃度差值ΔC=0.56ug/mL.該質(zhì)量濃度差值與2.2(2)中B組的質(zhì)量濃度差值ΔC=0.92ug/mL相比較，二者之間差別很小.

以上兩組數(shù)據(jù)表明，上述兩種提取方法對(duì)大花紅景天多糖都有一定程度的破壞.相對(duì)傳統(tǒng)水提法，超聲波提取工藝造成的破壞程度更低.

3 討論

超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的機(jī)械粉碎和空化作用，加速浸提物從原料向溶劑的擴(kuò)散速率，具有提取率高、不需要高溫、能耗低、提取時(shí)間大大縮短等優(yōu)點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)利用超聲波對(duì)大花紅景天多糖提取，并采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖得率.試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取大花紅景天的最佳工藝條件是：乙醇的體積分?jǐn)?shù)0%，溫度65℃，超聲時(shí)間20min，料液比1：15.由于多糖的不穩(wěn)定性，各種手段在提取過程對(duì)大花紅景天多糖都存在一定的破壞.相比傳統(tǒng)水提法，超聲提取時(shí)間短，相對(duì)破壞較低.同時(shí)，對(duì)比傳統(tǒng)水提的多糖得率(10.29%)和超聲波輔助提取的多糖得率(15.48%)，可知，超聲波輔助提取極大提高了大花紅景天多糖的提取率，在大花紅景天多糖的提取上有良好的應(yīng)用價(jià)值.

參考文獻(xiàn)：

[1]宋月英,馬玉珍,韓慧文,等.紅景天屬植物化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].中草藥,2004,35(2)：235-237.

[2]宋學(xué)偉,韓泳平,唐曉麗,等.大花紅景天揮發(fā)油的優(yōu)化提取條件及過程動(dòng)力學(xué)研究[J].華西藥學(xué)雜志,2005,20(5):383-384.

[3]李成,楊長(zhǎng)青,朱彩鳳,等.紅景天多糖提取工藝的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)藥,2006,17(10):1995-1996.

[4]邱遠(yuǎn)金,丁旭,譚勇,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化薔薇紅景天多糖的提取工藝[J].中國(guó)藥業(yè),2012,21(16):55-57.

[5]龔剛明,王化田,韓娜.超聲波法提取紅景天多糖[J].食品科學(xué),2005,26(10):127-129.