鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)丁胺卡那霉素耳毒性的保護(hù)作用

蔡琴芳 蔣立新

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)的成員，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、正常生理功能的維持及損傷后的修復(fù)有重要意義[1]。據(jù)報(bào)道，從小鼠頜下腺中提取的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子在臨床主要應(yīng)用于各類神經(jīng)損傷的修復(fù)[2]，NGF對(duì)噪聲性聾有一定臨床療效[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)給豚鼠腹腔注射丁胺卡那霉素(amikacin，AK)創(chuàng)建耳毒性動(dòng)物模型，同時(shí)肌肉注射N(xiāo)GF，采用ABR檢測(cè)和耳蝸基底膜鋪片觀察及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)探討NGF對(duì)丁胺卡那霉素所致聽(tīng)力損傷的保護(hù)作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組及給藥方法 取耳廓反射靈敏、健康雄性白色紅目豚鼠45只,體重350～400 g(廣東省動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分成對(duì)照組、中毒組、治療組三組，每組15只。對(duì)照組不予藥物處理；中毒組腹腔注射丁胺卡那霉素(金陵藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：080801)400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)10天；治療組同法給予丁胺卡那霉素的同時(shí)肌肉注射鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(廈門(mén)北大之路生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20050901)1 500 AU·kg-1·d-1，連續(xù)14天。

1.2ABR測(cè)試 分別于給藥前1天、給藥結(jié)束后第10、20天行ABR測(cè)試。豚鼠1%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉后行ABR測(cè)試。誘發(fā)電位儀型號(hào)：MEB-5304K(日本光電公司)，記錄電極置于顱頂部，參考電極和接地電極分別置于同側(cè)乳突部和鼻尖。耳機(jī)距豚鼠外耳道約0.5 cm, 采用頻率為11次/秒的短聲刺激，帶通濾波30～3 000 Hz，疊加512次，掃描時(shí)程10 ms。以波Ⅲ剛剛出現(xiàn)時(shí)的刺激聲強(qiáng)度作為ABR反應(yīng)閾值。

1.3改良耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片與方法 最后一次ABR測(cè)試結(jié)束后處死所有豚鼠并取出聽(tīng)泡，行基底膜硝酸銀染色鋪片觀察。與常規(guī)耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法[4]相比，本實(shí)驗(yàn)在曝光顯色和基底膜剝離上進(jìn)一步改良，鋪片效果滿意。暴露耳蝸后細(xì)針挑開(kāi)蝸?lái)敽蛨A窗膜并去除鐙骨，經(jīng)蝸?lái)斝】坠嘧?.5%硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗及10%中性福爾馬林灌注固定后將耳蝸浸入10% 中性福爾馬林中，放入4 ℃冰箱內(nèi)繼續(xù)固定4小時(shí)。用小尖鑷取出附有完整基底膜的蝸軸，放入盛有10%中性福爾馬林固定液的玻璃器皿中，置放于100 W的白熾燈下，待標(biāo)本變?yōu)樽睾稚笕∠峦暾幕啄?，甘油封片，高倍顯微鏡下觀察并攝片。在顯微鏡400倍視野下,計(jì)算基底膜各回毛細(xì)胞缺失百分率，以表皮板輪廓及纖毛消失作為毛細(xì)胞的缺失標(biāo)志。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠用藥前后ABR反應(yīng)閾變化 給藥前三組豚鼠間ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥結(jié)束后第10天及20天中毒組及治療組ABR反應(yīng)閾均高于對(duì)照組，但治療組ABR閾值低于中毒組(P<0.05)。對(duì)照組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療組及中毒組第10天ABR閾值均較給藥前升高(P<0.05)，但給藥結(jié)束后第20天與第10天ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 三組豚鼠用藥前后ABR閾值

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與中毒組比較，P<0.05；△與同組給藥前比較，P<0.05

2.2耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片觀察及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)照組耳蝸基底膜可見(jiàn)3排OHC和1排IHC排列整齊，OHC聽(tīng)纖毛成V字形，IHC聽(tīng)纖毛成一字型，偶有個(gè)別缺失(圖1a)；中毒組OHC缺失較多，從頂回至底回OHC損傷程度逐漸加重，且各回毛細(xì)胞均以第1排和第2排損傷為重，IHC個(gè)別缺失(圖1b)；治療組OHC散在缺失，IHC排列較整齊，少有缺失(圖1c)。中毒組及治療組各回毛細(xì)胞缺失率均高于對(duì)照組(P<0.05)，中毒組耳蝸基底膜除第四回外，其他各回毛細(xì)胞的缺失率均高于治療組(P<0.05)。對(duì)照組基底膜各回毛細(xì)胞缺失率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中毒組及治療組均以第一回毛細(xì)胞損傷最嚴(yán)重(P<0.05)(表2)。

圖1 三組豚鼠耳蝸基底膜鋪片圖(硝酸銀染色×400)

表2 三組豚鼠耳蝸各回毛細(xì)胞缺失率

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與中毒組比較，P<0.05

3 討論

丁胺卡那霉素(AK)的耳毒性機(jī)制目前尚不完全明確。研究表明，AK與毛細(xì)胞膜上的磷酸肌醇酯結(jié)合后破壞細(xì)胞膜的通透性并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[5]，特異性結(jié)合線粒體內(nèi)核糖體亞基引起線粒體功能障礙，致使能量代謝及蛋白質(zhì)合成障礙，導(dǎo)致大量自由基生成并進(jìn)一步損傷線粒體，引起細(xì)胞凋亡[6]。因毛細(xì)胞凋亡和神經(jīng)突觸損傷，螺旋神經(jīng)元喪失了必要的信號(hào)刺激和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而發(fā)生延遲性死亡，導(dǎo)致聽(tīng)功能進(jìn)一步損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中毒組動(dòng)物腹腔注射AK 10天后，ABR反應(yīng)閾較正常對(duì)照組明顯升高，基底膜硝酸銀染色鋪片顯示耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與ABR閾移變化一致，毛細(xì)胞缺失率明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明AK耳毒性造模成功。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子為一個(gè)118個(gè)氨基酸的多肽分子，通過(guò)與低親和性受體p75及高親和性受體TrkA結(jié)合而發(fā)揮作用。NGF及其受體對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的作用多年來(lái)一直受到重視，眾多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究[7]，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)NGF及其受體在內(nèi)耳發(fā)育、成熟的各個(gè)階段皆有不同程度的表達(dá)[8]，可見(jiàn)NGF對(duì)內(nèi)耳正常發(fā)育及成熟后正常生理功能的維持可能具有重要作用。為進(jìn)一步明確NGF對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的作用，Sobkowicz等[9]利用一種特殊的小鼠(Bronx waltzer deaf mouse)研究其在聽(tīng)覺(jué)傳入系統(tǒng)突觸發(fā)生過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)這種小鼠因5 號(hào)染色體上存在基因突變而表現(xiàn)出一種非常典型的特征：在傳入神經(jīng)與感覺(jué)上皮發(fā)生突觸聯(lián)系的階段，特別是在產(chǎn)前兩天到產(chǎn)后第三天，傳入神經(jīng)的突觸形成失敗，大量?jī)?nèi)毛細(xì)胞開(kāi)始變性死亡。而在培養(yǎng)基中加入NGF后，內(nèi)毛細(xì)胞與神經(jīng)末梢形成了穩(wěn)定的突觸鏈接。該實(shí)驗(yàn)證明NGF可以單獨(dú)誘導(dǎo)此過(guò)程，并且在突觸形成后維持持其正常功能。還有學(xué)者[10]將小鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)移植到成熟大鼠耳蝸鼓階后，分別蝸內(nèi)灌注NGF和人工淋巴液，觀察到NGF組與人工淋巴液組其發(fā)育表現(xiàn)有很大差別，在NGF組可見(jiàn)大量神經(jīng)突起從背根神經(jīng)節(jié)伸出，穿過(guò)骨螺旋板靠近螺旋神經(jīng)節(jié)及螺旋器，說(shuō)明NGF對(duì)神經(jīng)突起的形成及定向生長(zhǎng)有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組注射N(xiāo)GF后，耳蝸基底膜鋪片顯示毛細(xì)胞損傷較輕，毛細(xì)胞缺失率小于中毒組，且ABR反應(yīng)閾較中毒組明顯降低，說(shuō)明NGF對(duì)丁胺卡那霉素所致耳蝸毛細(xì)胞損傷及聽(tīng)損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NGF可促進(jìn)耳蝸神經(jīng)軸突再生、營(yíng)養(yǎng)螺旋神經(jīng)元、保護(hù)并修復(fù)神經(jīng)突觸有關(guān)。另外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)NGF可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)或直接促進(jìn)周?chē)偕窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)及血管形成[11]。所以NGF也可能通過(guò)促進(jìn)耳蝸微血管損傷修復(fù)和血管生成，增加柯替器血供，改善耳蝸微循環(huán)，促進(jìn)代謝及氧自由基等有害物質(zhì)排泄，從而減輕毛細(xì)胞的損傷并促進(jìn)修復(fù)。

聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)治療一直是耳科學(xué)及聽(tīng)力學(xué)研究領(lǐng)域的前沿課題之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)丁胺卡那霉素所致豚鼠聽(tīng)損傷的保護(hù)作用，為防治氨基糖苷類抗生素耳毒性和臨床治療感音神經(jīng)性聾提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

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